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仪器:LC-100 二元高压,Exformma 经济型C18色谱柱,5µm,4.6×250 mm,加保护柱。流动相:乙腈-O.05mol/L磷酸二氢钠溶液(50:50);波长为440 nm;柱温40℃,进样量20μl。理论板数按血竭素峰计算应不低于4000。对照品溶液的制备 取血竭素高氯酸盐对照品9mg,精密称定,置50ml棕色量瓶中,加3%磷酸甲醇溶液使溶解,并稀释至刻度,摇匀,精密量取1ml,置5ml棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀.即得(血竭素重量=血竭素高氯酸盐重量/1.377)。供试品溶液的制备取本品适量,研细,取O.05g,精密称定,置具塞试管中,精密加入3%磷酸甲醇溶液10ml,密塞。振摇3分钟,滤过,精密量取续滤液1ml,置5ml棕色量瓶中,加甲醇至刻度.摇匀,即得。血竭素的保留时间为6.4,但拖尾因子为3 ,不符合中国药典规定,请教大家如何处理?
[align=center]血竭含量测定[/align][color=#333333]1 材料与试剂[/color][color=#333333] 乙腈(色谱级)、磷酸二氢钠、磷酸、甲醇(分析纯)、血竭素高氯酸盐(购自中检院)、血竭样品(客户提供样品)。[/color][align=center][color=#333333][img=,690,260]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909121037225741_9698_1858223_3.jpg!w690x260.jpg[/img][/color][/align][color=#333333]2 色谱条件[/color][color=#333333] LC-20AT液相色谱仪(日本岛津),色谱柱:[/color][color=#333333]Zorbax SB C18(250mm*4.6μm*5μm)(安捷伦)[/color][color=#333333],流动相:以乙腈-0.05mol/L磷酸二氢钠溶液(50:50);检测波长为440nm;柱温40℃。[/color][color=#333333]3 样品制备[/color][color=#333333] 标准溶液的制备 取血竭素高氯酸盐对照品,精密称定,置50ml棕色量瓶中,加3%磷酸甲醇溶液使溶解,并稀释至刻度,摇匀,(血竭素重量=血竭素高氯酸盐重量/1.377)。[/color][align=center][color=#333333][img=,567,177]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909121038240511_6855_1858223_3.jpg!w567x177.jpg[/img][/color][/align][color=#333333] 供试品溶液的制备 取本品适量,研细,取0.[/color][color=#333333]05~0.15g,精密称定,置具塞试管中,精密加入3%磷酸甲醇溶液10ml,密塞,[/color][b][color=#333333]振摇[/color][/b][color=#333333]3分钟,滤过,精密量取续滤液1ml,置5ml棕色量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。[/color][align=center][color=#333333][img=,568,168]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/09/201909121038506921_4317_1858223_3.jpg!w568x168.jpg[/img][/color][/align][color=#333333] 小结:通过送检样品我们发现,样品有的是粉末,有的是硬块状,药典中规定研细,但是对于研细程度各有不同,觉得应该要求过筛,这样能保证样品的均匀性,研细的过程每个人操作程度不同,测出来的含量也有差别,本身中药的质量就参差不齐,所以标准规定应该更细一点,有利于数据的统计分析,测试过程中发现在样品准备中还有一点,药典规定振摇3min,是人工用手振摇还是说用机械振荡器振摇,都应该统一,这样数据才能保证更准确。[/color]
[align=center]薄层色谱血竭鉴别(3)样品处理注意事项[/align][align=left][b]小序:在没有自动点板仪的情况下,点板对技术人员的要求是比较高的,经过多次训练,点出来的板不比仪器点的差,实验中也会发现很多问题,并积累一定的经验。[/b][/align][b]1材料1.1药品与试剂[/b] 血竭:五批不同产地的血竭;甲醇:天津市致远化学试剂有限工司(分析纯);乙醇:天津市致远化学试剂有限工司(分析纯);盐酸:洛阳昊华化学试剂有限公司 氢氧化钾:北京化工厂;[b]1.2 仪器与设备[/b] 薄层色谱成像系统:Good See-20E 上海科哲生化科技有限公司;振荡器:调速多用振荡器 金坛市恒丰仪器制造有限公司;薄层板:青岛海洋化工有限公司,100mm*100mm;滤纸:抚顺市民政滤纸厂,中速,定性滤纸(11cm);[b]2方法与结果[/b] 取本品粉末0.5g,加乙醇10mL,密塞,振摇10分钟,滤过,滤液加稀盐酸5ml,混匀,[color=#ff0000]析出棕黄色沉淀,放置后逐渐凝成棕黑色树脂状物[/color][sup][color=#ff0000]【1】[/color][/sup]。取树脂状物,用稀盐酸10ml分次充分洗涤,弃去洗液,加20%氢氧化钾溶液10mL,研磨,[color=#ff0000]加三氯甲烷[/color][color=#ff0000]5ml[/color][color=#ff0000]振摇提取[/color][sup][color=#ff0000]【2】[/color][/sup],[color=#ff0000]三氯甲烷层显红色[/color][sup][color=#ff0000]【3】[/color][/sup],取三氯甲烷液作为供试品溶液。另取血竭对照药材0.5g,同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验,吸取上述两种溶液各10〜 20μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以三氯甲烷-甲醇(19:1 )为展开剂,展开,取出,晾干。供试品色谱中,在与对照药材色谱相应的位置上,显相同的橙色斑点。[align=left]【1】通过多组实验发现样品振摇后加稀盐酸,所有血竭样品都会有黄色沉淀,但并不是所有血竭都能凝成棕黑色树脂状物,有的没有树脂状物出现,离心去沉淀继续试验,放置时间2-3h保证棕黑色树脂状物出现完全。[/align][align=center][img=,588,309]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907090759286371_979_3917489_3.png!w588x309.jpg[/img][/align][align=left] 图一为三个有棕黑色树脂状物出现的样品薄层色谱图,图二为未出现棕黑色树脂状物的样品薄层色谱图,通过图一图二发现是否出现棕黑色树脂状物对色谱图实验结果影响并不明显(图一1点由于产地及加工工艺不同,存在含量多少差异,部分斑点不太清晰,但均存在;样品和对照药材点样量为10-20μL)。【2】加20%氢氧化钾溶液10mL,研磨,(图四)加三氯甲烷5ml振摇提取,提取液点板,(图三)加三氯甲烷1ml振摇提取,提取液点板。[/align][align=center][img=,591,304]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907090800410804_7561_3917489_3.png!w591x304.jpg[/img][/align][align=left] 图三加三氯甲烷1mL,样液浓度增加,样品斑点颜色较清晰,而图四加三氯甲烷5mL,样品点颜色较浅,可能干扰结果判断。由于鉴别(3)主要鉴别血竭红素,而血竭红素含量低,增加浓度更能突出血竭红素的斑点。[/align][align=left]【3】加三氯甲烷振摇提取,三氯甲烷层颜色呈淡红色,静置五分钟,三氯甲烷层颜色更深,提取更完全,样品斑点更清晰。[/align][align=center][img=,561,296]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2019/07/201907090801342408_7263_3917489_3.png!w561x296.jpg[/img][/align][align=left] 图五是加过三氯甲烷振摇后直接取三氯甲烷层点板,发现三氯甲烷层颜色较浅,样品斑点较浅。图六是加过三氯甲烷振摇后,静置五分钟后,发现三氯甲烷层颜色较图一颜色深,且斑点较清晰。[/align][b]3结果与讨论[/b] 综上所述,影响血竭鉴别(3)薄层结果的因素有:实验最后加三氯甲烷的体积的多少;振摇提取三氯甲烷层显红色是否放置一会。关于加过盐酸,析出棕黄色沉淀,放置后是否凝成棕黑色树脂状物对实验结果影响不大。同时除杂部分也要注意,血竭素比血竭红素含量高,除杂做的不好血竭素也会干扰实验结果。