吖丁啶

大家好，本周为大家分享一篇最近发表在Analytical Chemistry上的文章，Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting 1。该文章的通讯作者是美国百时美施贵宝的Jason M. Hogan研究员。抗体药物结合表位的测定是药物开发的重要环节。抗体的结合位点决定了它的药理学和药代动力学特性。本文采用化学印迹法结合质谱技术对MICA蛋白上的抗体结合表位进行了测定，单残基水平的分辨率能够展现更精细的结构信息。作者选择了两种包含有双吖丙啶基团的光催化标记试剂TDBA和3-azibutanol（如图1AB中的化学结构式）。在紫外光照射下，双吖丙啶基团会形成较高反应活性的卡宾中间体插入到氨基酸的X-H键中（X=C, O, N, S）中，进而实现较高水平的标记序列覆盖和结构分辨率。值得注意的是，TDBA和3-azibutanol在分子尺寸、极性以及对不同氨基酸的反应活性上都存在差异，因此两种试剂获得标记结果往往能展现一些互补的结构信息。作者首先对MICA与Fab-1的互作表位进行了测定。由于同一条肽段存在多个标记位点，每个位点的标记比例变化也不一样，所以肽段水平的标记往往反映是该肽段连带区域结构平均化的结果。图1AB为MICA与Fab-1结合后标记比例的变化。在MICA α3结构域中，共有34个残基被TDBA试剂修饰(图1A)。在这些残基中，发现18个位点的标记量在与Fab-1形成复合物后显著性地下降，3个位点的标记量显示出增加。如果按照肽段标记水平的变化来看，其中5个位点的结构变化信息则会被掩盖。相较于肽段标记量变化，计算单个残基的标记量变化能将抗体结合表位锁定到更精确的位置。将标记量下降的残基映射到MICA蛋白晶体结构上(图1C)，可以观测到大多数受保护的残基在α3结构域上形成了一个连续的表面。其中一个残基Q278显示出标记量增加，并且靠近TDBA定位的表位，表明它可能位于表位边缘或附近。其余差异标记残基位于远离表位的区域，可能是Fab-1结合时蛋白质结构构象变化导致的结果。在3-azibutanol的实验中，复合物形成后仅显示5个标记量显著性下降的残基和2个增加的残基(图1B)。四个标记量下降的残基R279、Y283、E285和H290在TDBA标记实验也观察到。两种标记试剂的测定结果可以相互验证，同时互相补充。3-azibutanol定位的表位覆盖了TDBA表位中的两个不连续区域(图1D)。整合两种标记试剂定位的表位区（图1E），对比X-射线晶体学测定的表位（图1F）发现大多数通过卡宾化学标记鉴定的表位残基被晶体结构证实，其余残基则位于晶体学表位外围的8Å范围内。以上结果均说明卡宾化学印记法在测定抗体结合表位上具有较高的准确性。图1 MICA与Fab-1的互作表位测定：A)TDBA, B) 3-azibutanol实验标记量的变化；使用C) TDBA, D) 3-azibutanol 定位的表位；E)整合标记试剂测定的表位；F) X-射线晶体学测定的表位。鉴于此，作者将卡宾化学印记法应用到了其他候选Fab与MICA结合表位的测定上。在实验开始之前，作者首先用生物膜层干涉（BLI）技术对几个Fab在MICA上的竞争结合关系进行了考察。如图2A所示，Fab3、Fab4、Fab5存在着竞争结合，表明它们结合的表位一致或表位之间存在重叠。而Fab1、Fab2与MICA结合相对独立，不受其他Fab的干扰，说明Fab1和Fab2都具有各自单独的结合表位。尽管生物膜干涉能够展现各个Fab结合表位的位置关系，但却无法实现更高分辨的定位。表面标记法则能很好地解决此问题。如图2B-G，通过卡宾化学印迹法的测定6个Fab的结合表位都实现了准确定位，位置接近或重叠的表位则会产生竞争结合，因此更精准地解释了Fab间的竞争关系。此外，作者还将卡宾化学印记法应用到了完整抗体Ipilimumab与CTLA-4结合表位的测定（图3），卡宾化学印迹法依旧展现出较高的分辨率，准确描绘出了Ipilimumab与CTLA-4结合表位轮廓。图2 A）通过生物膜层干涉测定6个Fab的竞争结合关系；B-G）卡宾化学印记法测定6个Fab的表位图3 卡宾化学印记法测定全长抗体Ipilimumab与CTLA-4互作表位总之，使用卡宾化学印迹可以快速定位抗体结合表位，以支持抗体药物的开发。两种标记试剂的使用增加了蛋白复合物表面标记残基的覆盖率，可提供互补结构信息。残基水平的标记细化了相互作用表面并且能够区分与结合表位不相关的远端调控。撰稿：刘蕊洁编辑：李惠琳原文：Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting参考文献1. Hogan JM, Lee PS, Wong SC, et al. Residue-Level Characterization of Antibody Binding Epitopes Using Carbene Chemical Footprinting. Anal Chem. 2023 95(8):3922-3931.

手机控也沉默的第一天 　　展览第一天，宾客如潮。(管它人多人少，小编就这样固执的认为了!)少年们忙着迎接莅临展台的领导、客户、新老朋友，一定是忙得不可开交。把&ldquo 不可开交&rdquo 四个字落在纸上容易，但怎么给各位看官解释明白呢? 　　小编一通挠头发拍大腿之后，(小刚导演说这样的模仿不好，so 偶不演，不演哈~)想到了这个：&ldquo 整整一个白天，现场的同事没发来一张照片，微信木有更新任何状态，连平时几乎要7*24的手机控小哥也惊人的，沉(默)了!&rdquo &mdash &mdash 现在各位看官知道会场有多忙了吧，忙到今儿的贵宾照也只能等小编回头再给您补了&hellip &hellip 　　CACA，华人的聚会 　　开展会的时候当然是忙疯了，但工作结束之后呢?恨不得天天走南闯北，四处飘(chu)荡(chai)的看官们，您们身在异乡的那些个夜晚吖，都是怎样的煎(huan)熬(le)呢?是逛街吃饭，感受风土人情?是跟客户/同事推杯换盏，联络深厚感情?还是早早钻进被窝里，刷手机，看电视，抓紧时间享受媳妇/女友不在身边时一个人的好(ji)心(mo)情(a)? 　　爆料!爆料!看看咱们的大人物Dr.Chen下班后的样子。。。看!看!就在这里哦! 北美华人色谱协会(Chinese American Chromatography Association ，CACA)聚会现场 　　Dr. Richard Henry 主席正在跟大家分享&ldquo Should Elevated Temperature Become More Useful or Less Useful for Modern hplc?&rdquo 　　没有找到Dr.Chen吧?失望了吧?那就对了。因为。。。照片是他拍的@-@~(小编不是shua您，表生气哈。怪就怪另外的两个少年云游去了，偶就这样不负责任的xia说了，谁让他们没给陈博士照相呢，让您失望了，回来俺说Ta哈~) 　　扯远了，拉回来。(=.=~)咱还是聊聊CACA吧。这个中西结合的&ldquo 北美华人色谱协会(Chinese American Chromatography Association，CACA)&rdquo 。CACA小盆友成立于2008年5月12日，是一个非营利组织，由在北美从事色谱相关领域研究的杰出科学家和在色谱领域创业的企业家组成。博纳艾杰尔总经理汪群杰博士也是创始人之一哦。由于协会会员居住地比较分散，因此选择在HPLC和Pittcon会议同期举办CACA的联谊会。迄今为止这样的聚会已经举办了8年。听说今年有100多位专家学者到场参会!大部分都是药厂的分析科学家!(&ldquo 人来的不少，我很欣慰~o(&cap _&cap )o 哈哈~&rdquo ) 　　CACA主席Tao Jiang博士在开始之初为大家介绍了协会的发展历程。真是太遗憾了，没能现场聆听这个传奇故事，小编从caca网站上扒下来了这段主席致辞，帮跟俺一样好奇的看官们复习下&ldquo 听说读 xie&rdquo 哈 　　致辞来了，英语不好的童鞋们要挺住吖~~~ 　　Message from the President 　　Dear Friends, 　　Welcome to the Chinese American Chromatography Association (CACA)! 　　CACA was formed on May 12, 2008 during the HPLC&rsquo 2008 conference in Baltimore, Maryland, USA. We are a non-profit organization and our missions are (1) sharing technical information in the area of separation sciences, particularly in the area of chromatography, within the United States and around the world (2) providing a network for members to share experiences and help each other in career development and (3) providing a forum for interacting and developing cooperative relationships with other separation organizations, particularly in mainland China, Taiwan, and Hong Kong. 　　Under the leadership of our former presidents, Dr. Yan-Bo Yang and Dr. Michael Ye, CACA has grown significantly in the past years. We have now more than 300 members from academia, government and industry. We have also established good relationship with other organizations, such as CASSS, MACC, LCGC and SepuNet. During the past years, CACA has successfully organized workshops and dinner events at Pittcon and HPLC conferences with many invited speakers from academia, government, and industry to give highly inspired speeches. We also have had many sponsors from industry, which made it possible financially to organize the events and provide assistance to students at these events. Please visit our website at www.ca-ca.org and LinkedIn group at http://www.linkedin.com/groups?mostPopular=&gid=1857030 for more information. 　　While members of the Association are mainly Chinese American and Chinese scientists working in the US, all separation scientists from other nationalities and other parts of the world are also welcome to join. The membership is on a voluntary basis and free of charge. 　　I hope to see you at one of CACA organized events in the near future. Please pass the information about CACA along to your friends and co-workers. 　　Good luck to you and CACA. 　　Tao Jiang, Ph.D. 　　President, CACA 　　您还没尽兴?得嘞~咱再贴张今儿的聚会日程。现场情景?!各位看官，尽情脑补去吧~ 　　Tao Jiang原来是位女侠啊 　　据悉，这位Tao Jiang博士师从关亚风老师哦!关亚风老师跟博纳艾杰尔可是老相识啦! 　　想想俺也算认识关老师了(有点儿大(da)言(yan)不(bu)惭(chan)哈~)，可这Tao Jiang博士真是第一回见。看合影才知道，竟然是位女侠!偶对您的敬仰真是犹如滔滔江水，绵延不绝&hellip &hellip Tao Jiang博士(左二)与博纳艾杰尔Dr.Chen团队合影 　　【为(mi)数(zu)不(zhen)多(gui)的现场合影】 　　美国时间临睡前，微信上出现了这样两张照片。真的不是只来了两个人，是少年们实在困了，累了，要睡了。。。好好睡吧，辛苦的人们!睡醒了新的一天就要来啦~~~ 　　======================隔天又来捣乱的&ldquo 分割线君&rdquo ! 　　帅哥戏狗，有图为证!xiong哥，你这么调皮，你家儿子知道吗 　　。。。 　　微信证明，偶是替你许过愿的：祝你顺利吃上米国2斤+的大龙虾，入口前记得上图啊!空盘的就别发了~~ 　　各位看官，咱不说今儿就到这儿了，因为我们懂得，您明儿还会来! 明儿见了，您呐!

溴化乙锭——美丽而危险 溴化乙锭（Ethidium bromide，EtBr）是一种经典的荧光染料，在分子生物学研究中有着广泛应用。其化学结构为三苯并咪唑，能够通过嵌入DNA或RNA 的碱基对之间进行非共价结合，从而显著增强荧光信号。这种染料最初作为兽医用药被发现，因其具有强效的诱变性和便捷的核酸染色能力，现已广泛应用于核酸检测、电泳分析及多种生物医学实验中。 一、 化学特性与结合机制 溴化乙锭是一种小分子染料，能够嵌入双链DNA和RNA的碱基对之间，显著增强其荧光强度。与双链 RNA 结合时，荧光强度可增强21倍；与双链DNA 结合时，荧光强度可增强25倍。虽然溴化乙锭在结合单链和三链DNA时亲和力较低，但其结合特性仍足以抑制DNA聚合酶的活性。这些特性使其成为研究 DNA复制、修复及转录的重要工具。 二、 溴化乙锭在科研中的应用 核酸检测 溴化乙锭在分子生物学实验中广泛用于核酸检测，特别是在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳中。通过在凝胶中加入溴化乙锭，研究人员可以在紫外光下观察到清晰的DNA或RNA条带，从而确定核酸的存在和大小。这种方法简便且高效，是实验室常规操作之一。 荧光定量分析 溴化乙锭的荧光特性使其在荧光定量分析中得到了广泛应用。例如，在定量 PCR和定量RT-PCR中，溴化乙锭通过测量荧光强度来定量分析DNA或RNA。溴化乙锭的高荧光增强效应显著提高了这些分析方法的灵敏度和准确性，广泛用于基因表达研究、病毒载量检测等领域。 细胞膜完整性评估 在细胞生物学研究中，溴化乙锭常用于评估细胞膜的完整性。由于溴化乙锭不能穿透完整的细胞膜，因此只有在细胞膜受损时才能进入细胞并与核酸结合发出荧光。这一特性使溴化乙锭成为检测细胞死亡和细胞膜损伤的有力工具，可用于药物筛选和细胞毒性评估。 线粒体 DNA 研究 溴化乙锭在线粒体DNA研究中也发挥着重要作用。线粒体DNA是研究细胞代谢、遗传疾病和衰老过程的重要对象。溴化乙锭能够有效地分离和分析线粒体DNA，为深入研究其功能提供了工具。例如，在研究线粒体DNA复制和突变时，溴化乙锭可用于追踪和定量分析线粒体DNA。 基因组编辑和转基因研究 在基因组编辑和转基因研究中，溴化乙锭也起到了重要作用。在使用 CRISPR-Cas9等基因编辑技术时，研究人员需要精确检测和定量目标基因的编辑效果。溴化乙锭染色结合荧光显微镜观察，可以帮助研究人员评估编辑效率和识别成功编辑的细胞。此外，在转基因生物的筛选过程中，溴化乙锭可用于检测转基因的插入和表达情况。 三、 光谱特性 溴化乙锭具有独特的光谱特性，其紫外/可见光吸收峰位于多个波长处，包括210 nm、285 nm、316 nm 和343 nm。当溶解在不同溶剂中时，这些吸收峰会发生变化。例如，在水中溶解时，吸收峰位于480 nm，而在甲醇中溶解时则位于520 nm。当与核酸结合时，溴化乙锭的吸收峰会发生红移（向更长波长移动）。 荧光特性 溴化乙锭的荧光特性在不同溶剂和环境中有所不同。在水溶液中，溴化乙锭的激发波长为526 nm，发射波长为605 nm。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，其激发波长为360 nm，发射波长为590 nm。此外，在10 mM TBE 缓冲液（pH 8.0）中，其激发波长为525 nm，发射波长为600 nm。随着溶剂极性的降低，溴化乙锭的荧光产量增加，使其在各种生物实验中具有广泛应用。 四、 储存和处理 溴化乙锭应在避光、干燥的条件下储存，以确保其稳定性。在室温下储存时，溴化乙锭粉末可保持稳定至少两年。处理溴化乙锭时应采取适当的安全措施，因为它是一种已知的诱变剂和潜在的致癌物。废弃的溶液和材料应按照规定的生物危害废弃物处理程序进行处理。 五、 配制溶液 在室温下，溴化乙锭在水中以10 mg/mL 的浓度溶解，形成红色溶液。它在水中最多可溶解到20 mg/mL，在乙醇中可溶解到2 mg/mL。水或PBS中的储备溶液在避光条件下至少可稳定两年。 六、 电泳染色步骤 在电泳实验中，溴化乙锭通常以0.5mg/mL 的浓度添加到凝胶和电泳缓冲液中。电泳后，可以将凝胶浸入含有溴化乙锭的缓冲液或水中染色30-45分钟。在某些情况下，可以通过将染色后的凝胶浸泡在水或1 mM MgSO4中进行脱色，以减少背景荧光，从而提高DNA的检测灵敏度。 七、 安全注意事项 由于溴化乙锭具有诱变和致癌风险，处理时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风良好的地方进行操作。所有含有溴化乙锭的废弃物应按生物危害废弃物处理，确保对环境和人体的安全。 溴化乙锭作为一种重要的分子生物学研究工具，其独特的荧光特性和广泛的应用领域使其在核酸检测和分析中发挥着关键作用。通过对其特性的深入了解和正确的使用方法，可以更好地应用溴化乙锭进行科学研究。