单磷酸酯

在国家自然科学基金的大力支持下(项目资助号：21021004)，中国科学院大连化学物理研究所邹汉法研究员在磷酸化蛋白质组分析技术方面获得新进展，相关成果发表在最近一期的Nature Protocols上(2013，8，461-480)。(http://www.nature.com/nprot/journal/v8/n3/abs/ nprot.2013.010.html)。 　　固定化金属离子亲和色谱(IMAC) 是磷酸化蛋白质组学研究中最常用的磷酸化肽段富集技术之一，常规的IMAC使用的螯合基团有三羧甲基乙二胺、次氨基乙酸、亚氨基二乙酸等，在螯合铁、镓等金属离子后可用于磷酸肽的富集。其缺点是特异性不高，在富集磷酸肽的同时也富集了一些酸性肽。研究人员发现了磷酸酯锆或钛表面与磷酸肽之间的高特异性相互作用，并利用这一相互作用建立了以磷酸基团为螯合配体的新一代固定化金属离子亲和色谱技术。实验表明，该新型IMAC对磷酸肽富集的特异性优异，可以有效避免酸性肽段的非特异性吸附。与传统的IMAC相比较，其对磷酸肽的富集能力提高3-10倍，从而大大提高了蛋白质磷酸化分析的检测灵敏度和鉴定覆盖率。该新型IMAC方法自2006年发表首篇论文以来，已在Mol. Cell. Proteomics, J. Proteome Res., Anal. Chem.等蛋白质组学与分析化学权威期刊发表论文20余篇，其中2007年发表在Mol. Cell. Proteomics的一篇论文已经被引用110余次。采用该方法为核心技术进行了人类肝脏蛋白质磷酸化的规模化分离鉴定，建立了迄今为止国际上人类肝脏蛋白质磷酸化的最大数据集 (Mol. Cell. Proteomics，2012，11，1070-1083)。

2013年5月2日，国家卫计委印发《2013年食品安全国家标准项目计划》的通知，通知中列出了所有2013年食品安全国家标准计划项目承担单位，全文如下： 　　国家卫计委关于印发《2013年食品安全国家标准项目计划》的通知 　　卫办监督函〔2013〕359号 　　各有关单位： 　　根据《食品安全法》和《食品安全国家标准管理办法》规定，我委在向社会公开征求意见的基础上制定了《2013年食品安全国家标准项目计划》，现印发给你们，请认真组织落实。有关工作要求如下： 　　一、填报项目委托协议书，及时落实食品安全国家标准项目计划 　　2013年食品安全国家标准计划项目承担单位应当填写《2013年食品安全国家标准制(修)订项目委托协议书》(可从卫生计生委网站http://www.moh.gov.cn下载)，打印后由承担单位负责人签字并加盖单位公章(一式五份)，于2013年5月20日前报送食品安全国家标准审评委员会秘书处(以下简称秘书处)。逾期未提交协议书的，视为自动放弃标准起草单位和起草人资格。秘书处对协议书进行审核后，于2013年5月31日前报送我委。 　　二、加强日常管理，确保食品安全国家标准项目及相关经费按时保质执行 　　(一)项目承担单位和项目负责人要加强食品安全国家标准制定、修订工作的管理，保证项目质量和进度，请于2013年12月30日前向秘书处提交工作中期进展报告和经费使用情况报告，于2014年6月30日前完成任务，向秘书处提交送审材料和经费决算报告。经费决算报告由财务负责人和单位负责人签字并加盖公章。 　　(二)未按期完成任务提交送审材料的，项目承担单位和项目负责人应当提交说明，并附经费使用情况报告，加盖单位公章后报秘书处。我委将视情况予以通报批评，并根据国家有关财经法规制度，对已拨付的项目经费采取追回等必要的处理措施。 　　(三)相关省(区、市)卫生厅(局、卫生计生委)、有关单位要支持并督促下属单位承担的项目工作，秘书处要督促检查项目执行情况，确保项 目计划整体进度。 　　2013050901.doc　　 2013年食品安全国家标准项目计划 序号 项目名称 制定/修订 建议承担单位 食品产品 1 藻类制品 修订 浙江省疾病预防控制中心 中国水产科学研究院 微生物检验方法 2 食品微生物检验采样与检样处理规程 修订 国家食品安全风险评估中心 理化检验方法 3 食品中B族和G族黄曲霉毒素的测定 修订 浙江省疾病预防控制中心 4 食品中M族黄曲霉毒素的测定 修订 浙江省疾病预防控制中心 食品添加剂质量规格 5 食品添加剂 4-己基间苯二酚 制定 中海油天津化工研究院 6 食品添加剂 冰结构蛋白 制定 中国食品添加剂和配料协会 7 食品添加剂 刺梧桐胶 制定 中国食品发酵工业研究院 上海市质量监督检验技术研究院 8 食品添加剂 甲基纤维素 制定 中国食品发酵工业研究院 9 食品添加剂 偏酒石酸 制定 天津科技大学 10 食品添加剂 植酸钠 制定 江西出入境检验检疫局 11 食品添加剂 羟基硬脂精 制定 中国食品发酵工业研究院 上海市食品添加剂行业协会 12 食品添加剂 海藻酸钠 修订 黄海水产研究所 中国海藻工业协会 13 食品添加剂 36项香料标准包括： 橙苷(柚皮甙提取物)、橙皮素、丁香花蕾油、根皮素、黄芥末提取物、可可酊、葡萄籽提取物、大蒜油、白兰花油、白兰叶油、红茶酊、玫瑰净油、杭白菊油、罗汉果酊、小花茉莉净油、树兰油、桂花净油、绿茶酊、椒样薄荷油、茶树油、香茅醛（合成）、香茅（精）油、麦芽酚、覆盆子酮(悬钩子酮)、丙酸苄酯、丁酸丁酯、异戊酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯甲酸苄酯、2-甲基吡嗪、2,3-二甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪、5-羟乙基-4-甲基噻唑、2-乙酰基噻唑、2,3,5,6-四甲基吡嗪、乙基香兰素 制定 国家食品安全风险评估中心 上海香料研究所 营养强化剂质量规格 14 维生素E琥珀酸钙 制定 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 15 硝酸硫胺素 制定 景德镇出入境检验检疫局 16 维生素C磷酸酯镁 制定 中国食品添加剂和配料协会 17 生物素 制定 中国食品发酵工业研究院 18 氯化胆碱 制定 中国食品添加剂和配料协会 中国食品发酵工业研究院 19 葡萄糖酸亚铁 制定 江西省疾病预防控制中心 20 焦磷酸铁 制定 上海市质量监督检验技术研究院 21 柠檬酸亚铁 制定 中国食品添加剂和配料协会 中国食品发酵工业研究院 22 柠檬酸铁铵 制定 广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心 23 柠檬酸苹果酸钙 制定 天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心 24 骨粉（超细鲜骨粉） 制定 江苏省疾病预防控制中心 天津科技大学 25 乳酸锌 制定江西省疾病预防控制中心 26 碳酸锌 制定 中国食品添加剂和配料协会 中国食品发酵工业研究院 27 亚硒酸钠 制定 张家港市产品质量监督检验所 28 硒蛋白 制定 湖北省疾病预防控制中心 29 富硒食用菌粉 制定 中国食品发酵工业研究院 中国食品添加剂和配料协会 30 L-硒-甲基硒代半胱氨酸 制定 江西省疾病预防控制中心 31 硒化卡拉胶 制定 中国食品添加剂和配料协会 32 富硒酵母 制定 中国食品发酵工业研究院 33 DHA（金枪鱼油） 制定 中国食品添加剂和配料协会 中国食品发酵工业研究院 34 葡萄糖酸锰制定 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 35 葡萄糖酸铜 制定 广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心 36 5’-单磷酸胞苷 制定 江苏省卫生监督所 37 乳铁蛋白 制定 中国食品发酵工业研究院 38 酪蛋白钙肽 制定 中国食品发酵工业研究院 中国食品添加剂和配料协会 39 海藻碘 制定 中国地方病协会 营养与特殊膳食食品 40 运动营养食品通则 修订 中国食品科学技术学会运动营养食品分会 41 孕产妇和乳母用营养补充品通用标准 制定 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所 生产经营规范 42 食品用菌种生产卫生规范 制定国家食品安全风险评估中心 43 航空食品生产卫生规范 制定 中国航空运输协会航空食品委员会 　　国家卫生和计划生育委员会办公厅 　　2013年5月2日

大家好，本周为大家分享一篇发表在J. Proteome Res上的文章：Defining the Sarcomeric Proteoform Landscape in Ischemic Cardiomyopathy by Top-Down Proteomics[1]，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的葛瑛教授。缺血性心肌病(Ischemic cardiomyopathy，ICM)是一种高度异质性的心血管疾病，大多数是由于左心室收缩功能障碍使得流向心脏的血液减少，从而导致氧气剥夺和心肌缺氧。ICM是心力衰竭的主要病因，是造成全球死亡率升高和疾病负担增加的主要因素之一，但其潜在的分子机制还有待深入研究。肌节作为心脏收缩的基本单位，由以肌动蛋白为基础的细肌丝和以肌球蛋白为基础的粗肌丝组成，它们附着在一个Z盘结构上。研究发现肌节蛋白质翻译后修饰(PTMs)和亚型的改变在心脏生理病理进程中扮演着重要角色。基于质谱的Top-down蛋白质组技术是以完整蛋白质为分析对象，可以提供不同表型心脏病蛋白质PTMs和亚型变化等生物信息，但目前还缺乏ICM肌节proteoforms图谱变化的相关报道。因此，作者利用Top-down蛋白质组学技术，在正常和ICM条件下构建了肌节proteoform图谱，并探究其变化对ICM发病机制的影响，从而为人类ICM的研究提供独到的见解。为了揭示ICM的分子变化情况，作者首先利用不同的pH条件，去除心脏功能正常的供体左心室(Left ventricular，LV)心肌组织(donor，n=16)和ICM患者LV心尖组织(ICM，n=16)的胞质蛋白质，对富集到的肌节蛋白质进行LC-MS/MS检测分析(图1)。心尖是在ICM患者进行左心室辅助装置植入手术期间获取的，实验已经证明LV和心尖组织具有相似的肌节proteoform图谱，两者可以进行相互比较。通过去卷积图谱上proteoform的峰强度与同一蛋白质所有proteoforms的总强度之比来进行蛋白质修饰水平的定量，而蛋白质表达的定量则依赖提取离子色谱图(EIC)峰下面积(AUC)的积分来计算。整个实验流程，从样品制备到LC-MS/MS分析，用时不到3h，表明该方法具有快速与高通量的优点。　　图1. 非标记Top-down蛋白质组学的实验流程：对无心脏病史的非衰竭供体(donor，n=16)和ICM患者(ICM，n=16)的LV组织进行肌节蛋白质的提取，然后进行LC-MS/MS分析。Top-down蛋白质组学策略提供了正常供体和ICM心脏组织中的proteoform图谱，如图2所示。作者检测到了许多肌丝蛋白，包括心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I，cTnI)、肌钙蛋白C(troponin C，TnC)、原肌球蛋白(tropomyosin，Tpm)亚型、α-肌动蛋白(α-肌动蛋白)亚型、心室型肌球蛋白轻链2(MLC-2v)、心室型肌球蛋白轻链1(MLC-1v)和心房型肌球蛋白轻链1(MLC-1a)，同时也检测到了多种Z盘蛋白，包括ENH2、肌肉LIM蛋白(muscle LIM protein，MLP)、富含半胱氨酸蛋白2(cysteine rich protein 2，CRIP2)、cypher-5、cypher-6、elfin、calsarcin-1(Ca1-1)和四个半LIM结构域蛋白2(four and a half LIM domains 2，FHL2)(图2)。随后，作者采用碰撞活化解离(CAD)模式对所有检测到的肌节蛋白质进行MS/MS分析，以进一步表征蛋白质。比如，实验结果显示MLC-2v上的磷酸化位点位于Ser19，并且实现了21%的序列覆盖率，这些数据表明Top-down的MS/MS分析可以对完整肌丝蛋白质进行测序，以用于蛋白质的鉴定和表征。　　图2. 正常供体和ICM患者心脏组织中的proteoform图谱。(a)代表性的基峰色谱图(BPC)表明肌节蛋白和Z盘蛋白呈高分辨分离(MLP、CRIP2、cTnT、ENH2、cypher-6、elfin、cypher-5、FHL2、calsarcin-1、cTnI、Tpm、MLC-1V、MLC-1a、MLC-2v、α-actin和TnC) (b)去卷积质谱图显示肌节蛋白和Z盘蛋白的多样性，红色p和pp分别表示单磷酸化和双磷酸化形式的proteoform。　　紧接着，作者对3个正常供体组织样本进行了LC-MS/MS检测，结果表明它们的BPC和总离子色谱图(TIC)，以及质谱信号强度的重现性非常好，证明了该分析方法稳健的重现性。为了比较两组样本间的蛋白质表达水平，作者对来自同一正常供体的组织样本，分别提取50、400、500、600、750、1000和1200 ng的总蛋白质进行LC-MS/MS检测以评估仪器响应线性，结果如图3a所示，它们表现出高度相似的proteoform图谱。图3b展示了代表性肌节蛋白(ENH2、cTnI、α-Tpm、MLC-1v、MLC-2v和TnC)的EIC，通过测定每个EIC的AUC丰度总和，建立了250~1200 ng的相互线性范围。如图3c所示，不同总蛋白量相关性结果的R2均大于0.99，表明该检测方法具有优异的重现性、灵敏度和线性，所以有信心将其用于样本间的蛋白质定量。　　图3. 关键肌节蛋白相互线性范围响应的测定。(a)50、400、500、600、750、1000和1200 ng总蛋白质的BPC，proteoform图谱高度相似 (b)ENH2、cTnI、α-Tpm、MLC-1v、MLC-2v和TnC的EIC(结合同一蛋白质所有proteoforms前3~5个最丰富电荷状态的离子) (c)每个肌节蛋白的AUC与250~1200 ng总蛋白(每个点重复3次)显示出相互线性相关(R20.99)。与正常供体样本相比，作者在ICM组中检测到了cTnI和ENH2的PTM和表达水平的显著变化。在供体和ICM组中，作者检测到了三种主要的cTnI proteoforms，包括未磷酸化的cTnI、单磷酸化的cTnI(pcTnI)和双磷酸化的cTnI(ppcTnI)同样也在两组中检测到了未磷酸化的ENH2和单磷酸化的ENH2(pENH2)(图4a)。与供体组相比，实验观察到ICM组LV组织中cTnI和ENH2表达水平的显著降低(图4b)，同时发现它们的总磷酸化水平在ICM组中也显著降低(图4c)，其中cTnI和ENH2的总磷酸化水平分别降低了35%和34%。此外，为了确定ICM组织中cTnI和ENH2磷酸化水平的降低是否相互依赖，作者对两者磷酸化水平进行了线性拟合，发现cTnI和ENH2磷酸化水平表现出很强的线性相关(r=0.8926，p0.00001)(图4d)。这些发现也与作者先前对肥厚型心肌病(Hypertrophic cardiomyopathy，HCM)患者心脏的研究结果相一致(Ying Ge, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2020 117(40):24691-24700)，表明可能是由异常的PKA信号通路介导了cTnI和ENH2磷酸化水平的协同降低。　　图4. ICM组中cTnI和ENH2磷酸化水平协同降低。(a)正常供体(蓝色)和ICM(红色)中代表性去卷积质谱图和EIC，红色p和pp分别表示单磷酸化和双磷酸化 (b)cTnI和ENH2表达水平的定量，两组在p0.05时被认为有统计学差异 (c)用mol pi/mol protein计算cTnI和ENH2总磷酸化，水平线代表组内中间值，两组在p0.001时被认为有统计学差异 (d)cTnI和ENH2磷酸化水平间的线性相关性(r=0.8926，p0.00001：线性相关性很强)。　　Tpm是一种细丝相关蛋白，共有几种可以与cTnT和α-actin相互作用以调控肌肉收缩的蛋白质亚型。作者在先前的研究中证实了人类心脏中存在α-Tpm、β-Tpm、和κ-Tpm，其中α-Tpm是表达最为丰富的亚型(Ying Ge, et al. J Muscle Res Cell Motil. 2013 34(3-4):199-210)。在本项研究中，未磷酸化的α-Tpm、单磷酸化的α-Tpm(pα-Tpm)和单磷酸化的κ-Tpm(pκ-Tpm)是主要检测到的TPM亚型(图5a)，而未磷酸化的κ-Tpm、γ-Tpm和skβ-Tpm丰度较低。与正常供体组相比，skβ-Tpm在ICM组中的表达显著降低，而α-Tpm和κ-Tpm在两组比较中无显著变化(图5c)。γ-Tpm的丰度太低，致使很难对其进行准确定量。尽管Tpm亚型的比例变化对心脏功能的影响还不得而知，但skβ-Tpm在ICM组中表达水平的显著降低同样也在先前HCM患者心脏中观察到(Ying Ge, et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2020 117(40):24691-24700)，因此有理由推断skβ-Tpm表达水平的变化可能会改变心脏功能，并使得ICM患者心脏收缩功能受损。除此之外，在正常供体组和ICM组中也都检测到了α-actin的两种亚型：骨骼肌α激动蛋白(Skeletal α-actin，α-SKA)和心脏α肌动蛋白(Cardiac α-actin，α-CAA)，如图5b所示。它们在心肌中共表达，在肌节结构和完整性中具有重要作用。与正常供体组相比，实验观察到α-SKA在ICM组中的表达显著增加(图5d)。结合作者先前观察到α-SKA在非衰竭供体心脏中的表达显著增加(Ying Ge, et al. Anal Chem. 2015 87(16):8399-8406)，实验结果说明衰竭心脏中表达上调的α-SKA可以作为一种有前景的心脏病生物标志物。　　图5. Tpm和α-actin不同亚型的表达。(a)Tpm在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图，共鉴定到α-Tpm、β-Tpm、κ-Tpm和γ-Tpm四种亚型，红色p表示单磷酸化和双磷酸化 (b)α-CAA和α-SKA在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图 (c~d)依据AUC进行Tpm和α-actin亚型的定量，两组在p0.005时被认为有统计学差异。　　作者也对Z盘蛋白质进行了鉴定和定量，例如MLP和Cal-1。图6a和图6c分别对应两种蛋白质的去卷积质谱图，其中MLP为未磷酸化和单磷酸化形式(pMLP)，Cal-1则表现出多种磷酸化proteoforms，包括单磷酸化(pCal-1)、双磷酸化(ppCal-1)和三磷酸化(pppCal-1)。与正常供体组相比，实验观察到MLP和Cal-1的总磷酸化水平在ICM组中的表达显著增加，分别增加了27%和4%(图6b和图6d)。MLP和Cal-1都与心肌病的发病相关，但目前尚未清楚PTMs如何影响其中的分子机制。本项研究首次揭示了ICM患者中MLP和Cal-1的磷酸化水平增加，但两者的总磷酸化水平呈负线性相关，说明它们不太可能被相同的激酶磷酸化或是在Z盘上有着密切的相互作用。　　图6. MLP和Cal-1在ICM组中的磷酸化水平增加。(b)MLP在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图，红色p分别表示单磷酸化的MLP (b)MLP总磷酸化的计算，两组在p0.01时被认为有统计学差异 (c)Cal-1在正常供体(蓝色)和ICM(红色)中的代表性去卷积质谱图，红色p、pp和ppp分别表示单磷酸化、双磷酸化和三磷酸化的Cal-1 (d)Cal-1总磷酸化的计算，两组在p0.05时被认为有统计学差异。基于质谱的Top-down蛋白质组学技术，本研究对供体和ICM心脏组织中的proteoform图谱进行了详细分析，观察到多个蛋白质在表达和修饰水平上发生了显著改变，总的结果在proteoform层面揭示了与晚期缺血性心力衰竭相关的分子变化。值得注意的是，作者发现cTnI和ENH2磷酸化水平在ICM组中协同降低，表明缺血性心力衰竭时PKA信号通路出现异常。此外，在ICM组中也观察到了MLP和Cal-1这两种Z盘蛋白磷酸化水平的显著增加，并且也检测到了ICM组中Tpm和α-actin不同蛋白亚型的表达变化。总的来说，本研究强调了在proteoform水平研究ICM的必要性，有助于揭示ICM的发病进程和开发可行的治疗方案。　　撰稿：陈昌明　　编辑：李惠琳　　原文：Defining the Sarcomeric Proteoform Landscape in Ischemic Cardiomyopathy by Top-Down Proteomics李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　1. Chapman EA, Aballo TJ, Melby JA, et al. Defining the Sarcomeric Proteoform Landscape in Ischemic Cardiomyopathy by Top-Down Proteomics. Journal of Proteome Research. 2023, 22 (3): 931-941.