溴酚蓝钠

(一)碱裂解法提取质粒[实验原理]碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。[实验仪器与设备]1.恒温培养箱 2.恒温摇床3.台式离心机(最大转速4000rpm) 4.冷冻高速离心机5.高压灭菌锅 6.超净工作台7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip[实验材料]1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲/烷(Tris)3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.氢氧/化钠5.十二烷基硫酸钠(SDS) 6.乙酸钾7.冰乙酸 8.氯/仿9.乙醇 10.胰RNA酶11.氨苄青霉素 12.蔗糖13.溴酚蓝 14.酚15.β巯基乙醇 16.盐酸17.含pUC18质粒的大肠杆菌附：试剂的配制1.溶液Ⅰ50mmol/L 葡萄糖5mmol/L 三羟甲基氨基甲/烷(Tris) TrisHCl (pH8.0)10mmol/L 乙2胺四乙酸(EDTA)(pH8.0)2.溶液Ⅱ0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合3.溶液Ⅲ5mmol/L 乙酸钾 60 ml冰乙酸 11.5 ml水 28.5 ml4.TE缓冲液10mmol/L TrisHCl1 mmol/L EDTA(pH8.0)5.70%乙醇(放-20℃冰箱中,用后即放回)6.胰RNA酶将RNA酶溶于10mmol/L TrisHCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20℃。7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚8.酚[实验步骤](一) 提取质粒1.将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000rpm，离心2min。3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。4.将细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10 min。5.加200μl溶液Ⅱ(新鲜配制)，混匀内容物，将离心管放冰上5 min。6.加入150μl溶液Ⅲ(冰上预冷)，盖紧管口，颠倒数次使混匀。7.1200rpm，离心15 min，将上清转至另一离心管中。8.向上清中加入等体积酚：氯/仿(去蛋白)，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中.9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。11.加50μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。(二)琼脂糖凝胶电泳检测DNA[实验原理]琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭(ethidum bromide ,EB)，在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。琼脂糖凝胶有如下特点：(1) DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。(2) 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率(u)的对数与凝胶浓度(t)成线性关系。(3) 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。(4) 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。(5) 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。(6) 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时(如误用蒸馏水配制凝胶，电导率最小，DNA几乎不移动，在高离子强度的缓冲液中(如误加10×电泳缓冲液)，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。[实验仪器与设备]1. 恒温培养箱2. 琼脂糖凝胶电泳系统3. 高压灭菌锅 4. 紫外线透射仪[实验材料]1.三羟甲基氨基甲/烷(Tris) 2.硼/酸3.乙2胺四乙酸(EDTA) 4.溴酚蓝5.蔗糖 6.琼脂糖7.溴化乙锭 8.DNA marker9.DNA样品[实验步骤]1.缓冲液的配制① 5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)配1000ml 5×TBE:Tris 54g硼/酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20mlPh8.0② 凝胶加样缓冲液(6×)溴酚蓝 0.25%蔗糖 40%③溴化乙锭溶液(EB) 0.5μg/ml2.制备琼脂糖凝胶按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围0.3% 5-60 kb0.6% 1-20 kb0.7% 0.8-10 kb0.9% 0.5-7 kb1.2% 0.4-6 kb1.5% 0.2-4 kb2.0% 0.1-3 kb3.胶板的制备(1) 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘(或电泳装置所皿备的塑料盘的开口)封住，形成一个胶膜(将胶膜放在工作台的水平位置上，用水平仪校正)。(2) 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液(1×TBE)。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率 。(3) 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。(4) 使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭(用水配制成10mg/ml的贮存液)到终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。(5) 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。(6)将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。(7)在凝胶完全凝固后(于室温放置30-45分钟) ，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。(8)加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。4.加样DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。 一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μl样品。已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。5.电泳在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。

一、蛋白样品制备　　之前和大家介绍过细胞和组织蛋白质的提取，当我们做WB的时候，需要对提取好的蛋白样品进行处理：在蛋白样品中加入SDS loading buffer 6X（蛋白上样缓冲液）稀释至1X（如蛋白样品有120ul，则加入SDS loading buffer 6X 600ul），混匀，75-95度加热10-15分钟，使蛋白变性以充分暴露抗原位点。在加热结束后，进行离心，使蛋白样品适当降温，防止PAGE胶被融化。　　PS：要测量的蛋白如果是磷酸化形式，一般加热到75度，一般情况可95度加热。市面上买到的SDS loading buffer 有2X的也有5X的，最后稀释至1X即可。　　那么为什么我们加入SDS loading buffer呢？主要就是用它的不同成分在电泳中起了关键的作用。　　SDS loading buffer 的主要成分及作用：A：0.1%溴酚蓝，作为指示剂，方便观察电泳进行的程度；B：10%甘油，密度大，增加样本的重量，可携带样本沉到底部；C：2%SDS，是一种阴离子表面活性剂，能打断蛋白质的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成为复合物，是蛋白质带满负电荷，从而是蛋白带电荷一致，减少电荷对电泳结果的影响；D：巯基乙醇还原剂，使蛋白质的二硫键断开，使得蛋白保持线性结构。　　二、蛋白上样　　1. 将之前配好的胶固定在电泳装置上，加入1X电泳液　　2. 拔出梳子，应该两侧同时用力，缓慢拔出，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使其变形，若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正。　　3.加入蛋白样品，一般10孔的梳孔，每孔可以加入20ul -40ul蛋白样品，15孔的梳孔，每孔可以加入10ul -30ul蛋白样品，是用微量注射器加样，平时我们也可以用普通的移液枪加样，尽量让枪头深入梳孔底物，防止蛋白样品飘出，一般在目的蛋白两侧加入等量的marker，如果两侧有空的梳孔，应该加入1X的loading buffer，起“压边”作用，可以使蛋白样品在一条水平线上往下跑。　　4.电泳：接上电极，正负极不要弄反，红色对红色，黑色对黑色，初始电压设为90V，当样品跑至分离胶时将电压调至120V，一般在溴酚蓝跑出胶时停止电泳，也可根据目的蛋白的分子量来选择跑的时间，如分子量较大，可以延长电泳时间，使得分子量大的marker跑的分散开，容易判断分子量。　　三、注意事项　　1.蛋白样品上样量最好相等，不要过多。　　2.不要过多重复使用电泳Buffer　　3.最佳分辨区在分离胶的2/3　　4.电泳后测定的分子量有10%的误差，不可完全信任。有些蛋白质由亚基（如血红蛋白）或两条以上的肽链（α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在巯基乙醇和SDS的作用下解离成亚基或多条单肽链，SDS-PAGE电泳法测定的只是它们的亚基或是单条肽链的相对分子量，有的蛋白质（如电荷异常或结构异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质）不能采用该发测相对分子量。　　5.如果电泳中出现拖尾，染色带的背景不清晰等现象，可能是SDS不纯引起。

&emsp &emsp 蛋白质免疫印迹杂交实验（Western Blotting）是成熟 mRNA 翻译指导蛋白质合成量分析检测手段中经典和广泛为业界认可的一种,也是论文中常见的数据呈现形式之一。虽然Western Blot实验原理比较简单，但是实验耗时长、步骤繁琐和实验结果重复性差，导致刚进实验室的小伙伴们，实验做的焦头烂额。&emsp &emsp 那么如何做出一手漂亮的Western Blot实验结果呢，请小伙伴们跟随远慕生物的脚步，了解Western Blot实验的相关知识，let's go！&emsp &emsp Western Blotting实验原理：&emsp &emsp 蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物（NC膜或PVDF膜）上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。&emsp &emsp Western Blotting实验步骤：&emsp &emsp -样品制备&emsp &emsp 样本制备是决定蛋白质免疫印迹是否成功的关键步骤之一。样本必须进行研磨、匀浆、超声处理。膜蛋白需用剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还需要注意的一点就是组织中的蛋白酶活性强，需要加入PMSF抑制酶的活性。远慕为大家提供强、中、弱三种RIPA裂解液，以及适用于各种类型的蛋白酶抑制剂。&emsp &emsp -电泳分离&emsp &emsp 准备好样品后，第二步就是上样和电泳分离了，上样之前小伙伴们要做的必要步骤是确定蛋白质浓度，根据蛋白质浓度确定上样量。远慕给大家推荐BCA和Bradford两款蛋白浓度测定试剂盒，小伙伴们可以根据自己的实验需求自行选择。&emsp &emsp 测完了蛋白质浓度，接下来就是上样了。首先要制备凝胶，选用SDS-PAGE凝胶配制试剂盒（EC0003），简单省时。然后安装电泳槽，将胶片安置在电泳槽中，在电泳装置中加入SDS-PAGE电泳液。远慕提供10×的电泳液，稀释后直接使用，方便快捷。&emsp &emsp 上样结束后，设置电泳程序一般浓缩胶80V，分离胶120V，电泳时间一般为1-2小时，根据溴酚蓝指示位置选择停止电泳时间即可。&emsp &emsp -转膜&emsp &emsp 针对特定分子量大小靶蛋白而选择适当转膜条件（转膜时间，转膜缓冲液和必要低温环境）能够将 SDS-PAGE 胶上蛋白样品尽可能完全转移到印迹膜上，同时减少蛋白不必要的降解，这对于终获得清晰、可信结果也是需要考虑因素。转膜方式主要包括湿式电印迹法（佳转膜方法）、半干式电印迹（可选的替代转膜方法）以及干式电印迹（有限灵敏度的转膜方法）。根据实验室习惯和需求，小伙伴们可以自行选择转膜方式。&emsp &emsp 膜的选择&emsp &emsp 膜的选择主要从实验目的和实验要求来考虑，例如做分子量小于20kDa的小蛋白，0.45um的膜是不可取的，因为可能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白含量不确定，从而影响终结果的可靠性。通常小于20KDa的蛋白选择0.2um的膜，而大于20KDa的蛋白选择0.45um的膜。&emsp &emsp 转膜方式的选择&emsp &emsp 湿转：&emsp &emsp 通常我们在做湿转的时候，选择100V恒压（高强度，因为低强度时间较长，且效率较低），电流控制在120-350mA之间，分子量在60KD以下的60分钟即可，分子量在60KD以上的需要延长转膜时间60-150分钟才能确保高效率的转膜。所以如果你所研究的两个蛋白分子量差异比较大（如GAPDH 37KD，Ki67 358KD），你可以考虑将胶从中间分开，两部分分别采用不同时间转印，能达到你理想的效果。电转液一般可以重复使用3次，之后电流会过大，不适合再使用。&emsp &emsp 半干转：&emsp &emsp 对于半干转来说，也需要进行堆叠组装（滤纸，胶，膜需要放在转印buffer中进行预平衡）放在装置电极板的底部，盖上上极板，高强的电流通过三明治结构，转印速度较快，一般小于1h。&emsp &emsp 需要注意的是：低温对于膜的转印是至关重要的，尤其是在转印时间较长而无人监管的情况下。针对刚建的实验室平台或者一些新蛋白的研究，经过转印的胶和膜都要通过染色确定转膜效率（胶用考马斯亮蓝加热染色，膜用丽春红染色，均只需几分钟，并不耽误太多时间），不然后面的实验既费时也费抗体。&emsp &emsp -封闭&emsp &emsp 在做Western blot实验中，因固相载体(如NC膜，PVDF膜)表面有很多孔，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补(堆积)和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面孔里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。&emsp &emsp 因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合，所以有“封闭”的说法。星博士在此介绍常见封闭液的一些特点，有助于大家选择：&emsp &emsp 常见的封闭液——BSA&emsp &emsp BSA是常用的封闭液，成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的，BSA有很强的免疫原性，会导致产生很多针对BSA的抗体，为避免交叉反应，不能用BSA，脱脂奶粉封闭，可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭液。&emsp &emsp 常见的封闭液——脱脂奶粉&emsp &emsp 脱脂奶粉大的优点是价格便宜，但由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。针对磷酸化蛋白的检测不能用脱脂奶粉，脱脂奶粉含有酪蛋白，该蛋白本身就是一种磷酸化蛋白，使用会造成高背景磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有生物素，不能用于生物素标记的抗体系统。&emsp &emsp 封闭体系并不是一成不变的，不同的封闭体系往往会得到不一样的实验结果，由此可见，做Western Blot实验中，封闭液的选择也是需要谨慎的。&emsp &emsp 不同封闭体系结果的差异&emsp &emsp -抗体孵育&emsp &emsp 一抗一般按照说明书进行稀释后，室温孵育1-2h，或者4℃过夜。为了让抗体充分与蛋白结合，大多数实验室一般会选择4℃过夜。一抗孵育结束后TBST洗涤三次，用稀释后的二抗，室温孵育1-3小时，TBST洗涤三次。&emsp &emsp 抗体是决定Western Blot实验成败的关键因素，选择具有一定文献引用数的品牌不仅容易得到清晰可信的结果同时能够得到同行认可，针对一些表达峰度高且稳定的蛋白可以选择国产化抗体，既能保证实验结果准确性又可降低实验成本，抗体的保存往往也是大家容易忽略的一个环节，而因抗体保存不当造成实验失败的例子比比皆是。&emsp &emsp 保存温度和条件（仅供参考）&emsp &emsp 对于很多抗体而言，分装成小等份并冻存于-20℃或-80℃是佳保存条件。分装成小等份可大程度减少由冻融造成的抗体效价降低，以及从单个试剂瓶中多次吸取而引入的污染。小等份只需冻融一次，如有剩余，可将剩余物保存于4℃，建议一周内用完。在收到抗体时，在10000×g下离心20秒以沉积截留于试剂瓶螺纹的溶液，并以小等份转移至低蛋白结合微量离心管中。小等份的量取决于实验人员在实验中通常采用的量。小等份应不小于10μl；等份越小，储液浓度因抗体蒸发及吸附于保存瓶表面而受到的影响越大。&emsp &emsp 在大多数情况下，收到抗体时在4℃下保存一至两周，然后再冷冻进行长期保存是可以接受的，但也许腹水液是例外，它可能包含蛋白酶，因而应该尽快冻存。不同品牌的抗体保存方式往往不同，具体保存方式需参考产品说明书。&emsp &emsp -检测&emsp &emsp 抗体孵育完，就到了Western Blot实验的后一步——检测了。&emsp &emsp 目前常用的检测方法是ECL化学发光法，主要针对HRP标记的二抗。远慕为大家提供极超敏和超敏两种ECL发光液供大家选择。一款合适的发光液能使你的Western Blot图片加美观