氰基苄烯

p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 【作者按】 /strong 日常评价一张图片质量的好坏，清晰不清晰往往排在第一位，大部分的图片没有了清晰度基本都被放入废片的篓子里面。这一评判标准也被许多杂志引入对科学图片的基本要求之中，即便是面对扫描电镜的图片，要求也是如此。许多科研论文被杂志社打回的原因有很多，图片的清晰与否正是常常被提及的重要原因之一。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 随着对扫描电镜成像原理的了解越深入、分析的越充分，越觉得以是否清晰做为扫描电镜图像最重要的评判标准，显得过于偏颇。特别是以图像清晰度不足为理由来否定图片中所反映出的形貌信息，这就充满了无理的偏见。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在进行扫描电镜测试时常常发现，图像的清晰度会随着放大倍率的提升而逐渐变差。如果用场发射扫描电镜进行测试，大部分样品的图像在放大到十万倍时还能保持较好的清晰度；超过十万倍，随着倍率的提高，图像清晰度将逐渐变差；放大倍数一旦超过三十万倍，大部分图像的细节清晰度都会下降的极其迅猛，很难获取所谓绝对清晰的结果。电子枪本征亮度和样品密度越低这种清晰度的下降速度就越大。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/5f73e72c-41a7-440c-ba2b-2c9e13fd51ee.jpg" title=" 1.PNG" alt=" 1.PNG" / /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/a5bec6d3-f243-4453-8202-13f9953d80fe.jpg" title=" 2.PNG" alt=" 2.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 钨灯丝扫描电镜，电子枪本征亮度低，该变化趋势要低一个数量级。一万倍以下清晰度优异，一万到五万倍清晰度尚可，五万倍以上下降明显，十万倍以上难以获得清晰图片。 /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/70af04d1-4e69-42ed-8477-c9bae441f0f1.jpg" title=" 3.PNG" alt=" 3.PNG" / /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/b403297c-5ded-4555-a4b2-432dda8dbe42.jpg" title=" 4.PNG" alt=" 4.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 为什么会出现这种图像高分辨与高清晰互相脱节的现象，即图像的高分辨却无法保证图像的高清晰？ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " & nbsp 下面将从图像的清晰度与辨析度谈起。 /p section style=" box-sizing: border-box text-align: justify " section style=" text-align: center margin: 10px 0% transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) 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vertical-align: middle display: inline-block line-height: 0 width: 100% box-sizing: border-box " img class=" raw-image" style=" vertical-align: middle max-width: 100% width: 100% box-sizing: border-box " data-ratio=" 0.3472222" data-w=" 1080" _width=" 100%" src=" http://statics.xiumi.us/stc/images/templates-assets/tpl-paper/image/14875fe29250c262c93674c03a33bba9-sz_5875.png" / /section /section /section /section /section /section /section p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 1.1 图像的清晰度 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 影像上各细部纹理及其边界的清晰程度 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 要保证图像细部纹理能被清晰分辨，纹理边界的明暗差异，也就是衬度，必须达到一定值。纹理边界的衬度差异越大，边界的区分就越明析，清晰度也就越高。& nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 1.2 图像的辨析度 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 影像上各细部纹理及其边界的分辨程度 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图像辨析度是对图像纹理细节分辨能力的概括性表述。图像的辨析度越高所能分辨的纹理细节就越细小、越丰富。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 1.3 图像辨析度的要求 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 对于相邻两点能被分辨的极限 strong 值 /strong ，也就是所谓的分辨率，被认为最具权威性的诠释是“瑞利判据”的概念。& nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 当两个物点的像斑重叠在一起，就有可能无法分辨这两个物点，到底重叠成怎样的程度刚好能分辨这两个物点？这就是一个分辨极限的问题。对这个问题，国际学术界通常都以瑞利提出的判据为准。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 瑞利判据：当一个爱里斑的中心与另一个爱里斑的第一级暗环重合时，刚好能分辨出是两个像。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/5de19146-9ddf-4a51-b264-d25a1e1e18ce.jpg" title=" 5.PNG" alt=" 5.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 依据瑞利判据的规定，我们对事物的分辨极限并不是处于清晰分辨，而是处于刚好分辨。此时图像的清晰度也不是要求绝对的清晰，而是足够的清晰，以至能刚好分辨细节。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " & nbsp strong 1.4 图像的衬度和清晰度 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 前文有介绍，图像衬度指的是图像上的明暗差异。正是存在明暗差异，才能形成图像，否则就是单纯的灰度或色度板。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " span style=" text-indent: 2em " 图像上细节边界的衬度差异越大，边界越容易被分辨，图像清晰度也就越高。细节衬度的影响因素有两个层次。 /span /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " span style=" text-indent: 2em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/88923449-2325-4edc-87fe-4dcb67bbdadb.jpg" title=" 6.PNG" alt=" 6.PNG" / /span /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " span style=" text-indent: 2em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/a758f67a-0d34-49d8-8ca3-6ac3d8f00b4a.jpg" title=" 7.PNG" alt=" 7.PNG" / /span /p p style=" text-indent: 0em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 从以上实例可见，细节边界的衬度值决定着图像清晰度，衬度越大清晰度越高。对这个衬度的影响来自两个方面： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a.& nbsp 图像整体对比度调整较差引发细节衬度弱，清晰度不足。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " b.& nbsp 图像细节部位的信息差异较小造成图像的清晰度不足。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 无论细节衬度不足来自哪方面的原因，要提升图像清晰度，增加细节的衬度是关键。通过提升图像的对比度来改善图像的清晰度，常常会丢失一部分样品细节。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 清晰度和辨析度经常以一种矛盾的态式而存在。提升清晰度是以损失辨析度为基础。清晰度高而辨析度不足、辨析度强但清晰度弱，两者往往很难兼得。该现象在扫面电镜中经常出现，特别在高、低倍率的图像对比中更是普遍现象。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/7338256e-bcb7-4425-8e91-207a23e8223f.jpg" title=" 8.PNG" alt=" 8.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 为什么扫面电镜高倍率图像清晰度往往较差，而且倍率越高清晰度越差？下面将从SEM的成像方式说起。 /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " span style=" text-indent: 2em " /span /p section style=" box-sizing: border-box text-align: justify " section style=" text-align: center margin: 10px 0% transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) -webkit-transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) -moz-transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) -o-transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) position: static 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border-box " img class=" raw-image" style=" vertical-align: middle max-width: 100% width: 100% box-sizing: border-box " data-ratio=" 0.3472222" data-w=" 1080" _width=" 100%" src=" http://statics.xiumi.us/stc/images/templates-assets/tpl-paper/image/14875fe29250c262c93674c03a33bba9-sz_5875.png" / /section /section /section /section /section /section /section p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 扫描电镜的成像方式类似电视，用一束高能电子在样品表面扫描，如同用电子束将样品分割成一个个小单元。各单元的面积影响着扫描电镜图像的像素单元面积大小，而图像像素单元的面积被认为是图像分辨力的决定因素之一。理论上来说：像素单元的面积越小，图像的分辨能力越强。图像的分辨能力越强，其细节的辨析度也越高。 br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 要提高扫描电镜图像的分辨能力，就要尽可能的将划分出来的像素单元面积降下来。但是当该单元面积降到一定程度时，必然会受到样品中电子信息溢出范围的影响，由此形成了扫描电镜表面形貌像的清晰度与辨析度之间的矛盾关系。如何认识这一矛盾的关系？30万倍以上图像为什么不清晰？是不是这种矛盾的关系只存在高倍率的图像中？ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.1 扫描电镜图像中辨析度与放大倍数的关系 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 扫描电镜是人类将视力往微观世界中去延伸的工具。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 一直以来的主流观点认为，人眼的视力极限为明视距离（25cm）下，最小能分辨相距0.1mm的两个小点，实际上人眼能轻松分辨的最小距离往往大于1mm。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 扫描电镜的作用就是将样品上两个小点的最小间距至少放大到人眼所能分辨的最小距离。假如人眼能分辨的最小间距定义为0.1mm，那么仪器要分辨1nm的细节就需要将该细节放大到0.1mm。此时扫描电镜的放大倍率是10万倍，该倍率也被称为1纳米细节的 strong 有效放大倍率 /strong 。现实中人眼能轻松分辨的是1mm左右；对应为30万倍放大3纳米的细节。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/8d3a9f8f-ac3c-4a2d-952b-612e357b8435.jpg" title=" 9.PNG" alt=" 9.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.2 扫描电镜图像细节清晰度与放大倍数的关系 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图像清晰度与细部纹理边缘的衬度有关。细部纹理边缘的衬度越大，细节越容易被清晰分辨，图像也就越清晰。扫描电镜图像的细节衬度主要取决于两个因素的比较： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 1.& nbsp 样品上所需区分的细节大小。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2.& nbsp 形成图像的电子信息集中溢出的单元面积。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 这两个面积之间的比值将会对扫描电镜图像的清晰度产生极大的影响。当样品上所需区分的细节面积远大于电子信息的溢出范围时，此时该溢出区的信息可以看成一个均匀的斑点，溢出区的电子信息不均匀分布就不会对细部纹理产生影响，细部纹理边缘的衬度也较大，图像将较为清晰。但是当这两个面积之间比值接近1:1时，甚至细节面积小于信息主体溢出区面积时，电子信息溢出时的不均匀分布就会对细部纹理的衬度产生影响，从而影响图像的整体清晰度。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 扫描电镜的细节分辨与放大倍数有很大的关联，放大倍数越大所能分辨的细节面积也就越小，也就越接近信息的扩散面积，对图像清晰度产生的影响也就越大。那么图像清晰度受到影响的放大倍数，即倍率阈值，最大能达到多少？ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 下面将从扫描电镜放大倍数与样品细节分辨以及电子束斑大小与信息溢出区面积的关系，这两个方面来切入探讨。 & nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.2.1 扫描电镜放大倍数与样品的细节分辨 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 日立扫描电镜图像的采集按照电子束在样品表面的扫描点阵，通常区分为：640× 480,1280× 960,2560× 1920,5120× 3840这几种模式，其中1280× 960用的最多。该模式表示电子束将样品的扫描区域划分为长1280份、宽960份。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 按照传统理念：同等面积，分割份数越多；同等分割份数，分割的总面积越小则分割出来的单元面积越小。单元面积越小获取的细节信息也越多，图像分辨率也越高。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 早期的扫描电镜图像尺寸，宽各厂家不一定相同，但是“长”都固定为5吋照片的尺寸，为127mm。因此这个值被称为“照片放大”尺寸，放大倍数也被称为：照片放大倍数。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " “照片放大”是目前唯一被各电镜厂家在计算放大倍数时所共同认可并采用的图像尺寸。故以下探讨都以“照片放大”的“长”，也就是127mm为标准来展开。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong A.& nbsp 扫面电镜的放大倍数（M） /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 扫描电镜的放大倍数（M）被定义为： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图像尺寸（L1）除以电子束在样品上的扫描范围（L2） /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/aa93b653-ea57-4fd9-907c-f692b414ccb8.jpg" title=" 10.PNG" alt=" 10.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong B.& nbsp 电子束在样品表面的扫描范围 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 依据公式可得出电子束在样品上的扫描范围L2 = L1/M。如果是“照片放大”，L1为定值127mm，那么L2=127mm/M。当M为10万倍时，L2为1270nm。也就是说放大倍数为10万倍时，电子束在样品上的扫描范围的长为1270纳米。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong C.& nbsp 电子束切割样品的单元面积 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 如果图像采集以1280× 960的扫描模式进行，那么电子束在样品上切割的单元面积边长L sub 2 /sub & #39 & nbsp 就是1270 ÷ & nbsp 1280 ?1nm。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 一切都十分理想的话，10万倍在理论上应该能区分1纳米的细节，这也是该倍率被认为是有效放大倍数的缘由。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 但扫描电镜分辨率并不是由电子束在样品上切割的单元面积，这个单一因素来决定。人眼的分辨力、样品电子信息溢出区的面积，将叠加在这个因素之上，共同对图像分辨率产生影响。最终结果，取决于这三方面单元面积之间的最短板，也就是取决于单元面积最大的那个因素。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在现实中，人眼在图像上能轻松分辨的是1mm距离，也就是在10万倍分辨10nm或30万倍分辨3nm细节。那么电子信息溢出区的面积，最小是多大呢？ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.2.2& nbsp 电子束斑大小与信息溢出区面积 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 电子束轰击样品，将激发出样品的各种信息。二次电子和背散射电子是形成样品表面形貌像各种衬度的两个主要信息源。其在样品表面的溢出区面积影响着样品表面形貌像的细节分辨力，溢出区面积越小，分辨力也就越强。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 那么这个溢出区有何特性？与电子束斑的大小有何关联？最小的溢出区有多大呢？下面将一一做详细的讨论。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong A.& nbsp 信息溢出区的特性 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 在经验谈(1)、(5)中有详细的介绍，在高能电子束轰击样品时，样品电子信息的溢出区将拥有以下两个特点： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 1.& nbsp 随着加速电压增加，电子束在极表层直接产生的二次电子（SE1）会减少，由内部散射电子引发的表层二次电子（SE2）会增多，并逐渐成为电子信息的主体。此时信息溢出区将扩大，样品表面细节随之被大量掩盖，图像辨析度也大大下降。这是低加速电压有更好的细节分辨的缘由。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 2.& nbsp 溢出样品表面的电子信息分布并不均衡。二次电子多集中在中心，形成内强外弱的形态。背散射电子的溢出特性则相反。信息源能量越大，溢出区面积越大、均匀性越差。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/da080f83-61de-4c0b-b942-242d51711297.jpg" title=" 11.PNG" alt=" 11.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong B.& nbsp 电子束斑的大小与信息溢出区面积的计算 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 以下是SEM三张经典的电子束束流与直径关系图 。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/e6a4c73b-b860-4a7c-8fca-6fb19f6104b7.jpg" title=" 12.PNG" alt=" 12.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 从图中可见，同等条件下，加速电压越小、束流越大，束斑直径越大。直径最小的是冷场电子枪，加速电压30KV、束流1pA，直径1.3nm左右；1kv、1pA，是2.6nm左右。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 实测时，电子束流不可能低至1pA，大于3KV的加速电压，对极表层信息抑制过大，不利于呈现5纳米以下细节信息。 span style=" text-indent: 2em " 故该尺度的表面信息常用 /span span style=" text-indent: 2em " 1KV /span span style=" text-indent: 2em " 甚至更低的加速电压来观察。此时束斑直径为 /span span style=" text-indent: 2em " 2.6nm /span span style=" text-indent: 2em " 左右，仅考虑能量最弱的二次电子在样品中的自由扩散，溢出区直径最小也不会小于 /span span style=" text-indent: 2em " 2.6nm /span span style=" text-indent: 2em " 。 /span /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 下面以1KV加速电压为参考来推断仪器的分辨率。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.2.3 扫描电镜的信息扩散范围与细节的分辨率 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 依据瑞利判据，理想状态下，假如两个点的半径相同，分辨率可认为等于信息扩散范围的半径。以1KV时束斑直径来计算，扫描电镜的细节分辨应该不优于1.3纳米。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 本人的SEM实测经历：从没有测试到被验证确实存在的1纳米细节。所能检测到，被氮气吸附脱附法验证存在的最小细节是：MOF材料中的ZIF-8，孔径为1.3 - 1.5纳米左右。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/90bbef0d-b5e8-48cf-afa5-378eb20cb052.jpg" title=" 13.PNG" alt=" 13.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.2.3 图像清晰度与溢出区半径的关系 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 对于扫描电镜来说要想清晰分辨半径为R1和R2的两点，这两点的中心至少应当间隔R1+R2的距离。否则两点之间将部分重合而使得清晰度下降，图像趋向模糊。如果两个斑点大小一致，这个距离就是直径。斑点的均匀性越好，边界衬度就越大，图像的清晰度也越高。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.2.4 扫描电镜放大倍数与图像清晰度 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 前面介绍，10万倍，采用1280× 960点阵，电子束在样品上分割的单元是边长为1纳米的区域，这完全满足细节分辨的需求，因此讨论图像细节清晰度时不需考虑它的影响。只需对比人眼所轻松分辨的最小距离和信息的扩散范围。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 加速电压过高（≥3KV）激发深度过大，极表层信息损失严重，不利于5纳米以下细节信息的呈现。1KV左右加速电压对这些细节的呈现影响小，是探讨分辨率和清晰度的基石。此时信息溢出区直径：≥2.6nm，契合30万倍区分3nm细节。因此保持图像清晰度的最大倍率阈值常为：30万倍。超过30万倍图像清晰度都不可避免的会受到一定程度的影响。 /strong /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/ee81ecb9-cdd4-4629-ac36-ff5471cfbac3.jpg" title=" 14.PNG" alt=" 14.PNG" / /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/d8b95d77-719d-4d7b-afd0-4ab6bfda6b2c.jpg" title=" 15.PNG" alt=" 15.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 2.3 扫描电镜图像辨析度与清晰度的辩证关系 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 前面探讨了扫描电镜图像的清晰度和辨析度与放大倍数之间的联系，以及为什么放大倍数到30万倍就必然对图像清晰度产生影响。下面将深入探讨它们之间的辩证关系。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 所谓辩证关系是指：对立统一、否定之否定、量变到质变。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图像清晰度和辨析度之间即有相互统一的一面，清晰度好辨析度也优异；但也存在相互对立的一面，辨析度越好清晰度却越差，转换点与放大倍数这个量的改变有关。引发清晰度和辨析度相互对立的放大倍率，可称为：倍率阈值，该值与样品电子信息的溢出范围有关。溢出范围越大，这个倍率阈值就越低，也就是说获取清晰图像的放大倍率越低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 信息溢出范围受以下因素影响：样品特性、电子枪本征亮度、加速电压及束斑大小、信号源能量。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 样品结构越松散、电子枪本征亮度越低、束斑越粗、加速电压过高或过低、信号源能量大则信息扩散范围大。引起清晰度变差的放大倍率阈值也低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " A）样品结构越松散，同等条件下SE1就越少，SE2会增多，在样品中形成的电子信息扩散对图像清晰度和表面细节影响也加大，不容易形成清晰的高分辨图像。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " B）电子束束斑面积增大，样品电子信息溢出的单元面积也随之增加且均匀性随面积的增加将变差，造成的结果是图像清晰度与辨析度俱佳的倍率阈值降低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 电子枪本征亮度的不足、束流及工作距离的增加、加速电压的减少都会使得电子束束斑面积得到增加。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " B1）电子枪本征亮度是表述电子枪性能的最重要指标。该值越小，同等条件下束流密度也就越小、会聚角越大。结果是信息的溢出范围随之增大，而信息量却随之减弱，图像清晰度及辨析度相一致的放大倍率阈值也低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " & nbsp 由于场发射电子枪和热发射电子枪亮度值相差极大，达三个数量级，因此成像质量如同本文开头所展示的，只要超过五万倍就将出现质的巨大区别。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " B2）束流及工作距离的加大都将增加电子束的离散性，同等条件下对图像的清晰度必然会产生影响。而对样品细节辨析度的影响因素不仅包含清晰度，探头对信息的接收角度对较大细节分辨的影响往往更为关键，起的作用也更大。这就引发了清晰度和辨析度偏离点的倍率阈值降低。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " B3）降低加速电压，会使得发射亮度减弱，电子束斑的面积及离散度增加，这将降低图像清晰度的倍率阈值。过高的加速电压也会使得间接二次电子（SE2）增多，当其成为形貌像的主要信息时，也会对图像的清晰度产生影响。加速电压越低对样品信息的激发越集中在表面，有利于表面信息的再现。以上特性都会对清晰度与辨析度的偏离程度产生影响。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " C）二次电子能量要远低于背散射电子，以它为主形成的表面形貌像在清晰度上拥有优势。但形貌细节是由探头接收样品信息的角度所形成，以背散射电子为主形成的形貌像往往拥有更好的信息接收角度，更擅长表现较大的样品细节。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 需要强调的是，任何因素的改变对结果的影响都有一个量变的积累过程，少量的变动对结果影响不大。多种因素的叠加或者单个因素的大范围变化才会带来的明显质变。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " D）实例的展示及探讨 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " D1）样品结构松散，保证图像清晰度的倍率阈值小。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/4695ef59-b688-4972-8a25-ca54b36dce8d.jpg" title=" 16.PNG" alt=" 16.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " D2）电子枪亮度对图像清晰度的影响 /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/754cdb8b-504f-48f9-b43b-fc04407be30d.jpg" title=" 17.PNG" alt=" 17.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " D3）改变加速电压对图像清晰度倍率阈值的影响 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/f96265e8-2454-461e-8530-ce59c3220aca.jpg" title=" 18.PNG" alt=" 18.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 增加加速电压，电子束发射亮度随之增大，这有利于扫描电镜图像的高分辨和高清晰。从信息的激发上来看，SE2的增加不利于表面细节的高分辨，当该信息增加为图像的主导因素时，对图像的清晰度也会产生不利的影响。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/179b2277-a816-4954-9bff-0693def43976.jpg" title=" 19.PNG" alt=" 19.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 低加速电压（1KV及以下），如500V。图像清晰度的倍率阈值随工作距离的加大，降低极为迅猛，辨析度也同步下降。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/3737d280-f42b-4115-9697-ec5c92a1b135.jpg" title=" 20.PNG" alt=" 20.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 以上三组图片为同一个样品在加速电压为500V时采用5mm、8mm以及15mm工作距离拍的三个不同倍率的图片。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图中可以看到：WD=5mm时在十万倍还能保证足够的清晰度和细节辨析度；WD=8mm时，只能在5万倍保持较好的清晰度；当WD达到15mm时，2万倍都无法保持图像的清晰度。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 1KV以下加速电压有利于呈现样品的极表层信息，对结构松散、细节细小的样品影响较小。但要降低该加速电压下的电子束离散现象，必须采用极小的工作距离（WD≦3 mm）。 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 小于5纳米的样品细节，体积过小，属于样品的极表层信息，大于3KV的加速电压往往对表面信息的激发过深，很容易掩盖掉这些信息。故对于这类信息的呈现常采用小工作距离、低加速电压（1KV及以下）的测试条件，如介孔材料。讨论高加速电压下的分辨率指标，个人经验是无稽之谈。 /strong /p p style=" text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/fc72eb28-6703-4797-950e-168f2c117c03.jpg" title=" 21.PNG" alt=" 21.PNG" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " D4）信息能量对保证图像清晰度倍率阈值的影响 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " & nbsp 背散射电子能量较大，在样品中扩散范围大。溢出范围及均匀性都较差，保持图像清晰度的倍率阈值也较低。对极小的样品细节（小于10nm）辨析度影响也较大。但低倍观察较大细节（200纳米），清晰度不受影响，辨析度优势明显。 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/433116f1-934f-4c3d-bab6-a636b841ec1b.jpg" title=" 22.PNG" alt=" 22.PNG" / /p p style=" text-indent: 0em text-align: center " img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202011/uepic/9e089ceb-63d5-4f04-b04e-8264bb9b9324.jpg" title=" 23.PNG" alt=" 23.PNG" / /p section style=" box-sizing: border-box text-align: justify " section style=" text-align: center margin: 10px 0% transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) -webkit-transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) -moz-transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) -o-transform: translate3d(-10px, 0px, 0px) position: static box-sizing: border-box " powered-by=" xiumi.us" section style=" display: inline-block min-width: 10% max-width: 100% vertical-align: top box-sizing: border-box " section style=" text-align: right transform: translate3d(10px, 0px, 0px) -webkit-transform: translate3d(10px, 0px, 0px) -moz-transform: translate3d(10px, 0px, 0px) -o-transform: translate3d(10px, 0px, 0px) position: static box-sizing: border-box " powered-by=" xiumi.us" section style=" display: inline-block min-width: 10% max-width: 100% vertical-align: top background-color: rgba(255, 255, 255, 0) padding: 10px 10px 2px 30px border-width: 0px 0px 2px border-radius: 0px 0px 2px border-style: none none solid border-color: rgb(80, 65, 158) overflow: hidden box-sizing: border-box " section style=" margin: 0px 0% transform: translate3d(1px, 0px, 0px) -webkit-transform: translate3d(1px, 0px, 0px) -moz-transform: translate3d(1px, 0px, 0px) -o-transform: translate3d(1px, 0px, 0px) position: static box-sizing: border-box " powered-by=" xiumi.us" section style=" text-align: justify font-size: 17px color: rgb(80, 65, 158) letter-spacing: 2px line-height: 1 box-sizing: border-box " p style=" white-space: normal margin-top: 0px margin-bottom: 0px padding: 0px box-sizing: border-box " strong span style=" background-color: rgba(254, 255, 255, 0) box-sizing: border-box " 三、结束语 /span /strong span style=" background-color: rgba(254, 255, 255, 0) box-sizing: border-box " /span /p /section /section /section /section section style=" text-align: left margin: -21px 0% 0px position: static box-sizing: border-box " powered-by=" xiumi.us" section style=" display: inline-block width: 61px height: 25px vertical-align: top overflow: hidden line-height: 0 letter-spacing: 0px box-sizing: border-box " section style=" text-align: center margin: 0px 0% position: static box-sizing: border-box " powered-by=" xiumi.us" section style=" max-width: 100% vertical-align: middle display: inline-block line-height: 0 width: 100% box-sizing: border-box " img class=" raw-image" style=" vertical-align: middle max-width: 100% width: 100% box-sizing: border-box " data-ratio=" 0.3472222" data-w=" 1080" _width=" 100%" src=" http://statics.xiumi.us/stc/images/templates-assets/tpl-paper/image/14875fe29250c262c93674c03a33bba9-sz_5875.png" / /section /section /section /section /section /section /section p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图像清晰度是指图像细部纹理的清晰程度。细部纹理边界的衬度大小将影响着图像的清晰程度。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 图像辨析度指的是图像细部纹理的分辨程度。细部纹理被分辨的越充分，其辨析度也就越高。依据瑞利判据：对图像细部纹理的辨析，只需要有足够的清晰度即可。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 扫描电镜图像清晰度取决于信息溢出单元的均匀性及面积大小与图像所呈现的细节面积之间的比值。细节面积越大于信息溢出单元，图像的清晰度越好。辨析度与仪器的放大倍率有关，倍率越高，电子束划分的单元面积越小，图像越能呈现更小的细节，也越接近信息溢出单元的面积大小。当两者面积相当，图像清晰度必然会受到信息溢出区均匀度的影响而变差。进一步的是，辨析度也会受到信息溢出单元面积的限制，分辨率不会优于信息溢出单元的半径。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 扫描电镜图像的清晰度和辨析度之间存在着既对立又统一的辨证关系。保持图像清晰度和辨析度的统一，存在一个倍率阈值。一旦越过这个倍率阈值清晰度和辨析度就相互背离，即图像辨析度高而清晰度变差。该倍率阈值与样品的特性、电子枪的亮度、加速电压、束流大小、工作距离、信息源的能量等因素有关。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 紧密的样品结构、较大的电子枪本征亮度、较低的信息源能量、较小的工作距离和电子束束流以及合适的加速电压都有利于提升保证图像清晰度和辨析度相统一的倍率阈值。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 样品的结构和电子枪本征亮度是扫描电镜测试过程中的固有条件无法更改，但它们却是决定测试结果能获取多大倍率阈值的根基。冷场电子枪本征亮度最大，因此它保证高倍率图像清晰度和辨析度的能力最强。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 信息源、工作距离、加速电压以及束流的选择是扫描电镜测试过程中的变量，它们的正确选择对你获取足够充分且清晰的形貌像极为关键。这些条件的选择对最终结果的影响都具有两面性， strong 辨证的思维模式对正确的条件选择极为关键 /strong 。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 采用能量较小的二次电子，有利于缩减信息的扩散范围。较小的工作距离会减少电子束的离散度、促进镜筒内探头获取更充分的二次电子、压缩能量较高的背散射电子对图像细节和清晰度的影响。结果：保证图像清晰度的倍率阈值较高，有利于展现较小的样品细节（& lt 10nm）信息。但缺点在于探头接收样品信息的角度不佳，对充分展现较大的样品细节信息（& gt 20nm）不利，使得该类样品信息的图像清晰度足够，表面细节却缺失严重，清晰度和辨析度形成较大的偏离。 !--10nm）信息。但缺点在于探头接收样品信息的角度不佳，对充分展现较大的样品细节信息（-- !--10nm）信息。但缺点在于探头接收样品信息的角度不佳，对充分展现较大的样品细节信息（-- !--10nm）信息。但缺点在于探头接收样品信息的角度不佳，对充分展现较大的样品细节信息（-- !--10nm）信息。但缺点在于探头接收样品信息的角度不佳，对充分展现较大的样品细节信息（-- /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 束流较低，束斑的尺寸也相应的较小。信号溢出区面积也会较小且均匀，这有利于提升图像清晰度的倍率阈值，但却会引起图像信号量的缺失，不利图像的信噪比和细节辨析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 改变加速电压对图像的清晰度和辨析度同样也会带来正反两个方面影响。提升加速电压会增加电子束的发射亮度，使得电子束的密度增加、会聚角减小，有利于缩小电子束直径同时增加电子束的强度和收敛性，但不利之处在于电子束激发样品内部信息（SE2）增多而直接激发的极表层信息减弱，对极表层信息的呈现不利。依据实际测试经验，大于3KV的加速电压不利于小于5纳米表面形貌细节的呈现，如介孔类样品。这类样品信息需要采用1KV甚至更低的加速电压在极小的工作距离（3mm以下），选用极为充足的二次电子来予以呈现。该加速电压下采用大工作距离，虽然形貌信息更充分但是电子束的离散度及探头接收信息的量都会严重不足，使得保持图像清晰度的倍率阈值也下降的较为明显，超过一定程度也会对细节信息的分辨产生影响。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 以上结果的演化都遵循着量变到质变的原理。最终结果取决于各个变量的 strong 负面量 /strong 的积累是否会引发质变的产生。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 综合以上分析我们可以推断：扫描电镜表面形貌像的极限分辨率应该出现在1KV加速电压，而此时电子束斑引起的信息扩散范围应该在2.6纳米左右，依据瑞利判据仪器的分辨率应该在半径范围，即1.3纳米左右。即便样品密度极高，引发的信息扩散极少，也很难出现低于1纳米的细节分辨。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 人眼在图像上能轻松分辨1mm的细节，对应着图像放大30万倍后轻松分辨3纳米的细节，与1KV加速电压下的信息溢出范围（3纳米左右）相契合，因此在进行扫描电镜测试时往往发现放大30万倍以上的图像，清晰度很难得到保证。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 30万倍可被认为是保持图像清晰度的最高倍率阈值。超过30万倍，图像清晰度都会有不同程度的下降，冷场扫描电镜由于电子枪亮度最大，因此下降幅度最小。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 随着以上对图像清晰度的不利因素叠加，保持图像清晰度的倍率阈值会有不同程度的下降。对于冷场扫描电镜（regulus82系列）来说：500V加速电压、15毫米工作距离这个极差的测试条件下，保证扫描电镜图像清晰度的倍率阈值还是能保持在1万倍左右。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 参考书籍： /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 《扫描电镜与能谱仪分析技术》 张大同 2009年2月1日& nbsp span style=" text-indent: 2em " 华南理工出版社 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 《微分析物理及其应用》 丁泽军等 2009年1月& nbsp span style=" text-indent: 2em " 中科大出版社 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 《自然辩证法》 恩格斯 于光远等译 1984年10月& nbsp span style=" text-indent: 2em " 人民出版社 /span span style=" text-indent: 2em " & nbsp & nbsp /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 《显微传》 章效峰 2015年10月 清华大学出版社 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 作者简介： /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 68px height: 103px float: left " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202010/uepic/97fabfc9-e32f-4731-9623-40143ec93450.jpg" width=" 68" height=" 103" / 林中清，1987年入职安徽大学现代实验技术中心从事扫描电镜管理及测试工作。32年的电镜知识及操作经验的积累，渐渐凝结成其对扫描电镜全新的认识和理论，使其获得与众不同的完美测试结果和疑难样品应对方案，在同行中拥有很高的声望。2011年在利用PHOTOSHIOP 对扫描电镜图片进行伪彩处理方面的突破，其电镜显微摄影作品分别被《中国卫生影像》、《科学画报》、《中国国家地理》等杂志所收录、在全国性的显微摄影大赛中多次获奖。& nbsp & nbsp /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 延伸阅读： /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a href=" https://www.instrument.com.cn/zt/LZQ" target=" _self" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 【系列专题：安徽大学林中清33载扫描电镜经验谈】 /span /strong /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 林中清系列约稿互动贴链接（点击留言，与林老师留言互动）： /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " a href=" https://bbs.instrument.com.cn/topic/7656289_1" target=" _self" style=" color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline " strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " https://bbs.instrument.com.cn/topic/7656289_1 /span /strong /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " br/ /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " strong 【专家约稿招募】 /strong /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 为促进电子显微学研究、电镜应用技术交流，打破时空壁垒，仪器信息网邀请电子显微学领域研究、技术、应用专家，以约稿分享形式，与大家共享电子显微学相关研究、技术、应用进展及经验等。同时，每期约稿将在仪器信息网社区电子显微镜版块发布对应互动贴，便于约稿专家、网友线上沟通互动。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 若您有电子显微学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：yanglz@instrument.com.cn）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em " 本期分享的是林中清老师为大家整理的33载扫描电镜经验谈之清晰度与辨析度 span style=" text-indent: 2em " ，以飨读者。 span style=" text-indent: 2em color: rgb(127, 127, 127) " （本文经授权发布,分享内容为作者个人观点，仅供读者学习参考，不代表本网观点。） /span /span /p p style=" text-align: center " br/ /p

高分辨氢氘交换质谱技术解析天然免疫受体构象变化与信号传导机制 MDA5是细胞内的异体RNA监测蛋白，属于RIG-I样受体家族（RLRs）的重要成员。MDA5参与多种RNA病毒引起的免疫反应，是天然免疫的一道重要屏障。RLRs家族共有RIG-I、MDA5及LGP2三个成员，其中RIG-I和MDA5的N端均拥有串联CARDs结构域，可通过CARD-CARD同型相互作用招募MAVS，最终促进I型干扰素（IFN）通路的激活。在RLRs抗病毒信号的激活过程中，K63连接的多聚泛素链（K63-polyUb）起着关键作用[1]。前期研究发现，短链K63-polyUb可以通过共价锚定和非共价锚定两种方式有效地促使RIG-ICARDs的寡聚[2, 3]。形成的异源四聚体复合物（K63-polyUb-RIG-ICARDs）可激活MAVSCARD寡聚，形成MAVS纤维的核心[2, 3]。然而，K63-polyUb是如何调控MDA5 CARDs组装以及招募、激活MAVS CARD的分子机制，仍是待解决的科学问题。 Immunity近期中国科学院上海药物研究所郑杰团队在Immunity杂志上以Research Article形式在线发表了题为“Ordered assembly of the cytosolic RNA-sensing MDA5-MAVS signaling complex via binding to unanchored K63-linked poly-ubiquitin chains”的研究成果，本研究通过生物大分子氢氘交换质谱技术（HDX-MS）以及冷冻电镜技术（Cryo-EM）揭示了长链，非锚定K63-polyUb促进MDA5-MAVS组装程序与信号传递的分子机制。MDA5-MAVS首先研究人员建立了K63-，K48-连接泛素链的生化合成平台，并制备了不同长度的K63-polyUbn（2≤n≤14）（图1）。通过基于Orbitrap Fusion平台的氢氘交换质谱技术（Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry，HDX-MS），研究人员发现MDA5CARDs和RIG-ICARDs的氢氘交换保护程度依赖于不同长度的K63-polyUbn（MDA5: n≥8 RIG-I: n≥3）而不依赖于K48-polyUbn（n≥10）；并且保护强度随着K63-polyUb的长度增加而特异性加强。 图1：HDX-MS分析K63-polyUb（2≤n≤14）对RLR CARDs寡聚的影响（点击查看大图） 为了研究K63-polyUbn介导的MDA5CARDs寡聚体的组装机制，研究人员利用冷冻电镜首次解析得到了分辨率为3.3Å的MDA5CARDs与K63-polyUb13复合体的结构。这也是MDA5CARDs第一个近原子分辨率的冷冻电镜结构。 那么MDA5CARDs-K63-polyUbn异源四聚体又是如何招募其下游信号蛋白MAVS？研究人员进一步通过Cryo-EM解析得到了分辨率为3.2Å的由长链K63-polyUb11拴系的“自下而上”的左手螺旋MDA5CARDs-MAVSCARD复合体结构。 同时研究人员通过生物大分子氢氘交换质谱技术，首次证明了人类MDA5全长蛋白的CARDs在初始状态下处于张开的构象并可与长链K63-polyUb10结合。然而在早期研究中，氢氘交换质谱已经证明了RIG-ICARDs在初始状态下呈闭合的构象[4, 5]。这也直接证明了RIG-I和MDA5的CARDs在溶液状态下构象上的巨大差异。其次，研究人员进一步发现K63-polyUb10拴系的MDA5CARDs复合物在溶液中的稳定性受MDA5的RNA依赖的ATP酶活性别构调节。图2：HDX-MS分析全长MDA5在其识别配体或底物作用下（dsRNA/ATP/K63-polyUb）的动态的构象变化与信号传导机制（点击查看大图）综上所述该研究通过生物大分子氢氘交换质谱和冷冻电镜技术发现长链，非锚定K63-polyUb类似于一个“分子桥梁”，促进了MDA5CARDs四聚体的组装，使之形成一个激动状态的构象来招募下游MAVSCARD，以进一步促进MAVSCARD的寡聚和激活（图2）。激活状态下的MDA5可以结合并水解ATP，远程提升CARDs-K63-polyUb10的稳定性以持续激活MAVS。该研究弥补了MDA5通路激活与信号传导研究的空白，进一步揭示了长链，非锚定K63-polyUb在细胞内作为内源性激动剂的免疫学功能，为理解泛素分子多样性在抗RNA病毒天然免疫信号传导与调控中的作用提供了新的线索。* 上海药物所博士后宋斌和美国NIH Research Associate陈运为论文第一作者，上海药物所郑杰研究员为论文的通讯作者。该工作得到了新加坡南洋理工大学罗大海教授、吴彬教授，美国Scripps研究所Patrick Griffin教授，上海药物所罗成研究员和张乃霞研究员的大力支持，得到了国家自然科学基金、上海市浦江人才计划等项目的支持。 专家访谈郑杰（中国科学院上海药物研究所 研究员）Q根据您的经验对氢氘交换质谱技术的理解？以及这篇文章的主要的难点在哪里？答：我觉得HDX-MS是基于生物化学这个学科，围绕表征酶活反应机理的一个很实用的技术，HDX-MS第一个应用是来自美国工业界，可以很好地应用于药物发现。这个新工作的一个难点就是采用生化合成了不同长度的K63多聚泛素链，并对RLR CARDs进行了后续功能筛选和表征。如果无法系统合成K63-polyubn（n＞8），我们也无法解决这个科学问题。Q基于高分辨质谱技术的HDX-MS技术作为捕捉蛋白质溶液构象变化的重要研究工具，相对于冷冻电镜技术提供哪些不可或缺的生物学信息？答：HDX-MS和cryoEM提供的信息非常互补，首先，两者联用可以提供高分辨的结构和溶液中动态构象变化的信息。其次，在我们这个研究中，我们使用了HDX-MS去表征MDA5全长蛋白的一系列的构象变化，这对cryoEM研究是很有难度的，因为全长MDA5 的CARDs和Helicase之间的linker长度达到了120个氨基酸且在溶液中是非常活跃的，我们这次利用了HDX分析了MDA5与RNA，ATP互作如何远程调控CARDs与K63-polyub的构象变化。表征好这一系列的构象变化就是表征MDA5在溶液状态下是如果进行信号传导的机制。QHDX-MS技术目前有哪些应用方向，未来应用前景如何？答：HDX-MS捕捉的是溶液状态下蛋白质稳态的信息，研究蛋白质动力学，这对药物发现（drug discovery）研究非常关键，可以大大加速药物的发现与研发。HDX-MS可以直接提供药物与小分子互作，以及生物大分子抗体药物识别抗原等研究提供接近生理意义的重要信息。我博士后是在美国Scripps研究所Patrick Griffin教授进行的训练，当时实验室的同事很多都去了美国大药企利用HDX-MS参与药物发现。其中Mike还在礼来公司搭建了一套高通量全自动的HDX设备，专门为礼来的小分子药物发现筛选而设定。回国后我们也正朝着这个方向努力，实现HDX-MS软件和硬件的进一步自动化，希望未来在国内可以实现HDX-MS高通量。另一个努力的方向是早日实现单氨基酸残基分辨率的HDX-MS技术的升级，这可以 帮助精准表征药物作用关键氨基酸残基。为了实现这个目标，HDX-MS的自动化进样平台机械臂模块需要一定的改造，比如更严格的控温，更高频率的连续进样来优化质谱的采集效率。最终我希望可以利用高通量HDX-MS平台去建一个蛋白库，提供氢键，自由能，单氨基酸残基HDX等可以量化的参数，更精准的帮助科研工作者了解蛋白质的折叠，去折叠等稳态的信息。 关于作者中国科学院上海药物研究所郑杰实验室长期结合生物大分子氢氘交换质谱技术交叉解决由蛋白质（酶）的动力学异常变化所导致的重大疾病的发生机制，聚焦RNA天然免疫模式识别受体的内源，外源性配体识别与信号传导机制，以及自身免疫疾病发生机制。围绕氢氘交换及其应用，以第一作者或通讯作者在Immunity 2021，Anal Chem 2019，Nat Commun 2018，structure 2018， Nat Commun 2017，Nucleic Acids Res 2015等期刊上。感谢郑杰老师对本文的指导与支持参考文献：1. Hu, H. and S.C. Sun, Ubiquitin signaling in immune responses. Cell Res, 2016. 26(4): p. 457-83.2. Zeng, W., et al., Reconstitution of the RIG-I pathway reveals a signaling role of unanchored polyubiquitin chains in innate immunity. Cell, 2010. 141(2): p. 315-30.3. Peisley, A., et al., Structural basis for ubiquitin-mediated antiviral signal activation by RIG-I. Nature, 2014. 509(7498): p. 110-4.4. Zheng, J., et al., High-resolution HDX-MS reveals distinct mechanisms of RNA recognition and activation by RIG-I and MDA5. Nucleic Acids Res, 2015. 43(2): p. 1216-30.5. Zheng, J., et al., HDX-MS reveals dysregulated checkpoints that compromise discrimination against self RNA during RIG-I mediated autoimmunity. Nat Commun, 2018. 9(1): p. 5366.扫描下方二维码即可获取赛默飞全行业解决方案，或关注“赛默飞色谱与质谱中国”公众号，了解更多资讯+

在太阳光或一缕LED紫外光照拂下，玻璃烧杯中加入一点点白色粉末，无须加热也无须其他能源，烧杯里的水便可源源不绝产生氢气，且经过数百小时的实验，这种白色粉末的量并未衰减。在云南大学材料与能源学院实验室，你能见到这样的“奇观”。　　在碳达峰、碳中和背景下，洁净的氢成为未来的重要能源，高效、低成本制氢，特别是光解水制氢是科学家研究的方向。1月10日，国际著名期刊《自然通讯》发表了云南大学柳清菊教授团队与英国伦敦大学学院唐军旺教授团队、华东师范大学黄荣教授团队合作的一项重要研究成果——以单原子铜锚定二氧化钛，成功制备新型光催化剂，其分解水制氢量子效率高达56%，被审稿人称为“世界纪录”。这意味着“水变氢”有了一条可实用化的新路径。　　提高催化效率 才能助推光解水制氢走向实用化　　氢能是一种清洁无污染的可再生能源，燃烧值很高，可达每千克140兆焦耳，其具有来源丰富、燃烧产物无二次污染等优点，有望代替石油和天然气，因而受到世界范围的广泛关注。若能得以大规模实际应用，将为“双碳”目标的顺利实现作出贡献。　　“目前，制备氢的主要方法有化石燃料制氢和电解水制氢，但两种方法都需消耗传统能源。”柳清菊向科技日报记者介绍，化石燃料制氢，二氧化碳排放量大，每生产1千克氢气，将产生10千克左右的二氧化碳；而电解水制氢也存在能耗和成本问题。“在环境和能源问题日益严重的今天，开发清洁、可持续、低成本的制氢技术，推进氢能的发展显得尤为迫切和重要。”柳清菊说，采用光催化技术，利用太阳能驱动水分解制氢是一种极具发展前途的新方法。　　自1972年科学家发现二氧化钛半导体具有光催化性能以来，光解水制氢一直受到学术界及产业界的关注与重视。在能量大于或等于半导体禁带宽度的光照射下，光催化材料价带中的电子吸收入射光子的能量跃迁到导带，形成“电子—空穴”对，空穴和电子迁移到材料表面，与表面吸附的水分子发生氧化还原反应，也就是电子与水发生还原反应产生氢气，空穴氧化水产生氧气。　　然而，由于电子带负电，空穴带正电，使得光催化材料中光照所产生的“电子—空穴”很容易复合，导致产氢量子效率低下，严重阻碍了光解水制氢的发展。因此，如何阻止“电子—空穴”的复合，提高光催化制氢效率，成为目前国际上光催化研究领域的重大挑战之一，也是制约光催化制氢技术实用化的瓶颈难题。　　这其中，光催化材料是核心。而光催化材料的活性、稳定性和成本是决定光催化技术能否实际应用的关键。　　铜离子“补位” 新型光催化材料设计制备突破瓶颈　　金属单原子催化剂是近年来迅速发展起来的新型催化剂。相比传统金属催化剂，金属单原子催化剂中的原子以单个的形式负载在载体上，在催化反应中可充分参与反应，实现反应活性中心的最大化，利用效率可接近100%，在理论上可以同时提高催化活性并降低成本。然而由于单原子具有极高的表面能，在合成和催化反应过程中容易团聚、稳定性差、寿命短且制备成本高，阻碍了其实际应用。　　“这次起光催化作用的二氧化钛，是一种钛和氧规则排列的晶体，我们通过独特的合成工艺，在其中生成大量的钛空位。”柳清菊向记者解释，有了这些钛空位，就可以请铜离子来帮忙“补位”。　　“通过对钛基有机框架材料MIL-125中钛空位的设计和可控合成，我们研制出具有大比表面积和丰富钛空位的二氧化钛纳米材料，以此为载体锚定过渡金属铜单原子，使铜与二氧化钛形成了牢固的‘铜—氧—钛’键。”柳清菊介绍，在光催化制氢反应过程中，一价阳离子铜和二价阳离子铜的可逆变化，大大促进了光生“电子—空穴”的分离和传输，大幅提高了光生电子的利用率，使产氢量子效率获得突破，达到56%。这项突破获得了欧洲科学院院士、伦敦大学学院光催化和材料化学终身教授唐军旺团队的验证。　　成本、工艺更“亲民” 光解水制氢产业已初露曙光　　新研制的二氧化钛基光催化材料，具有性能稳定、无毒、无二次污染等优点，且生物相容性好、制备方法简单、成本低，与传统方法相比优势明显。通常含贵金属的催化剂，催化活性高，但相应的成本也极高。“新材料中，我们用的是‘贱金属’铜，它储量大、价格低、易获得，这是成本降低的第一个方面。” 柳清菊介绍，此外，原有的催化材料中单个金属原子活性很大，很容易形成团簇，使得催化活性降低。研发团队将铜原子牢固地锚定在钛空位上，不容易团聚，创新性地解决了这个问题，稳定时间很长，在常温常湿条件下，样品放置380天之久，仍然具有与新制备样品相当的产氢性能，进一步降低了产氢成本；另外，新型光催化材料制备工艺简单，无需昂贵的设备，使光催化制氢更加“亲民”。　　近年来，柳清菊团队在实验室进行了大量的基础研究，包括材料设计、合成工艺、机理研究、性能优化等，已获得稳定的高性能光解水制氢光催化材料的实验室制备工艺，正准备开展放大工艺研发，为后续产业化奠定基础。虽然传统的光催化材料成本高、量子效率低，国内光催化产氢市场尚未成熟，但随着产业链衔接及相关政策的完善，光催化制氢产业化已是曙光初露。　　对柳清菊团队而言，56%的产氢量子效率也不是终点。“我们还在继续努力，使效率进一步提高，如果能够提高到70%以上，对生产应用的意义将是不言而喻的。”柳清菊说，找准了方向，效率再提升将不是梦。随着光解水效率进一步提高和成本进一步降低，氢能时代将加速到来，人类也将还地球以绿水青山。