多糖纯化色谱

目的 从虎眼万年青中提取、分离水溶性多糖，初步研究其特征和抗肿瘤活性。 方法 采用热水提取，乙醇沉淀，Sevag法脱蛋白，DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱色谱和Sephadex G-75凝胶过滤柱色谱分离纯化，得到虎眼万年青均一多糖OCAP-2-2。毛细管区带电泳法（CZE）分析单糖组成；采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)测定多糖纯度和相对分子质量；动物移植性实体瘤的瘤重实验法研究对小鼠S180肉瘤的抑瘤作用，采用细胞体外培养技术，MTT法检测对人白血病细胞株K562细胞的增殖抑制作用。 结果 经过分离纯化得到的均一多糖组分OCAP-2-2主要由葡萄糖、木糖、甘露糖、半乳糖等4种单糖组成，其相对分子质量之比为2.16∶1.26：0.88∶1.00，平均相对分子质量9.84×104，总糖含量为92.3%，总糖醛酸含量为6.21%，蛋白质含量为3.68%；在0.1～100 μgmL-1内与荷瘤对照组相比，OCAP-2-2对小鼠S180肉瘤有显著的抑制活性，其中多糖浓度为100 μgmL-1时抑瘤率达（53.16±4.23）% ([i]P＜[/i]0.001）；OCAP-2-2对K562细胞有明显的增殖抑制作用（[i]P＜[/i]0.01），在多糖浓度为0.10 μgmL-1时，增殖抑制率最高为（39.83±7.31）% ([i]P＜[/i]0.01）。 结论 OCAP-2-2具有很高的抗肿瘤活性，可以探索作为一种潜在的天然抗肿瘤药物。

各位前辈好！最近想买用来分离β-葡聚糖的凝胶填料柱，分子量范围大概在8x104~1.6x106之间，看网上和书上的凝胶填料范围大多数写的是分离的蛋白质分子量的，有点小纠结了，这个是通用的吗？以蛋白质的分子量来看选择纯化多糖的填料准吗？大家有木有合适的、用的好的凝胶填料厂家，或者说明书啥的哈，谢谢各位了！

[align=center][/align][font=宋体]一、原理[/font][font=宋体]1.[/font][font=宋体]多糖的分级与纯化[/font][font=宋体]多糖纯化的实质是将粗多糖中的杂质（包括蛋白质、色素、低聚糖、无机盐等非糖物质）除去而获得分子量和极性均一的多糖组分。比较常用的方法有：醇沉法、超滤法和柱层析法等。其中柱层析法应用比较普遍，多用于样品的精细分级,具有操作简单，重现性好的优点，但样品上样量小。用于多糖分离的柱层析主要有两类：一类是通过分子量大小进行分级的凝胶柱层析，如Sephadex G-100（200、50、25、10）、SepharoseCL-6B等系列；另一类是离子交换层析，是根据多糖所带电荷的性质不同选择相应的离子交换柱对多糖进行分级。如待分离的多糖带有负电荷，可选择阴离子型的DEAE-纤维素柱或DEAE-Sepharose柱进行分级，以获得均一的多糖组分。[/font][font=宋体]通过热水煮提方法提取的多糖，通常是混合物，且分子量不均一，其单糖组成、分子结构和聚合度往往不同，可通过柱层析的方法，对其进行分级以达纯化的目的。本实验中，采用[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素柱层析的方法对中草药中水溶性粗多糖进行分级纯化，分离纯化出各级分多糖，[/font][font=宋体]为后续研究多糖的结构特征和生物活性奠定基础。[/font][font=宋体]2.[/font][font=宋体]苯酚—硫酸法[/font][font=宋体]游离的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在浓硫酸的作用下，脱水生成糠醛，再与苯酚作用起显色反应，在一定范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，吸收值与糖含量呈线性关系。且己糖在[/font]490 nm[font=宋体]处（戊糖及糖醛酸在[/font]480 nm[font=宋体]）有最大吸收，故用比色法测定多糖含量。该法简单，快速，灵敏，且颜色持久，同一台设备同一光源仅需制作一条标准曲线。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]二、步骤[/font]1.[font=宋体]中草药水溶粗多糖的提取流程[/font][font=宋体]中草药粉末[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]蒸馏水浸泡过夜[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]超声[/font]/[font=宋体]微波[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]水浴浸提[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]过滤去除药渣[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]定容[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]多糖含量测定[/font][font=宋体]加等体积[/font]95%[font=宋体]乙醇[/font][font=Symbol][/font]4[font=宋体]℃冰箱过夜，醇沉多糖[/font][font=Symbol][/font]5000r/min[font=宋体]离心去上清液[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]粗多糖[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]脱蛋白[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]脱色素[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]透析[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]浓缩[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]冷冻干燥得水溶多糖[/font][font=Symbol][/font]DEAE-[font=宋体]纤维素色谱柱[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]收集多糖组分[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]测定每[/font]50s[font=宋体]洗脱液的[/font]OD[font=宋体]值[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]绘制横坐标为管数与纵坐标为[/font]OD[font=宋体]值的洗脱曲线[/font][font=宋体]根据洗脱曲线收集多糖溶液[/font][font=Symbol][/font]4[font=宋体]℃无水乙醇醇沉过夜[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]离心[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]多糖沉淀[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]常规干燥[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]纯度鉴定[/font][font=Symbol][/font][font=宋体]纯多糖[/font]2.[font=宋体]脱蛋白[/font][font=宋体]由于粗多糖中含有一定量游离的和结合的蛋白，为保证多糖的纯度，必须将蛋白质脱去。常用的脱蛋白方法有[/font]Sevag[font=宋体]法、三氯乙酸法和蛋白酶法（如链蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）等。[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font]Sevag[font=宋体]法[/font][font=宋体]根据蛋白质在有机溶剂（如氯仿）中易发生变性析出的特点[/font][font=宋体]，把多糖配制成[/font]5%[font=宋体]的糖液，然后按照[/font]1:3[font=宋体]的体积比加入[/font]Sevag[font=宋体]试剂（氯仿∶正丁醇[/font]=4[font=宋体]∶[/font]1[font=宋体]），混匀后剧烈振荡，静置分层后吸去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质，重复操作多次，直到除尽蛋白质为止。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）三氯乙酸法[/font][font=宋体]将粗多糖配成[/font]5%[font=宋体]的糖液，加入[/font]30%[font=宋体]三氯乙酸溶液，使三氯乙酸终浓度为[/font]15%[font=宋体]，在[/font]4℃[font=宋体]冰箱中放置过夜，离心弃去沉淀，得无蛋白的多糖溶液，再用[/font]1 mol/L NaOH[font=宋体]溶液中和至[/font]PH[font=宋体]为[/font]7[font=宋体]。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）蛋白酶法[/font][font=宋体]将粗多糖配成[/font]5%[font=宋体]的糖液，用酸碱调[/font]pH[font=宋体]至中性，加链蛋白酶[/font]0.5 L[font=宋体]，放恒温箱中[/font]37℃[font=宋体]保温[/font]24 h[font=宋体]后，加热升温至[/font]80℃[font=宋体]使酶失活，离心，得无蛋白的多糖溶液。[/font]3.[font=宋体]脱色[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font] [font=宋体]活性炭法[/font][font=宋体]将脱蛋白后的多糖配成[/font]5%[font=宋体]的糖液，用[/font]NaOH[font=宋体]溶液调[/font]pH[font=宋体]为[/font]4.5[font=宋体]，加入活性炭粉末，于[/font]80℃[font=宋体]保温[/font]2 h[font=宋体]后过滤。反复进行[/font]3[font=宋体]次，直到溶液颜色不再降低为止。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）过氧化氢法[/font][font=宋体]将脱蛋白后的多糖溶液，用浓氨水调至[/font]pH[font=宋体]为[/font]8.0[font=宋体]，逐滴滴加[/font]20%H[sub]2[/sub]O[sub]2[/sub][font=宋体]至溶液为浅黄色，[/font]50℃[font=宋体]水浴，保温[/font]2 h[font=宋体]后过滤。[/font]4.[font=宋体]透析脱盐[/font][font=宋体]将脱蛋白、脱色后多糖配成[/font]5%[font=宋体]溶液，置于透析袋中，先用自来水逆向流水透析[/font]72 h[font=宋体]后，再用蒸馏水透析[/font]24 h[font=宋体]，每[/font]4 h[font=宋体]换水一次。[/font]5.[font=宋体]干燥[/font][font=宋体]将脱蛋白、脱色、脱盐后的中草药多糖溶液，水浴[/font]80℃[font=宋体]浓缩至[/font]10 mL[font=宋体]，加三倍体积的无水乙醇过夜，离心取沉淀，经无水乙醇、乙醚洗涤后，常规干燥得中草药去蛋白去色素的多糖。[/font]6.[font=宋体]多糖含量测定[/font][font=宋体]采用苯酚[/font]-[font=宋体]硫酸法测定样品中的多糖含量。绘制标准曲线，根据葡萄糖标准曲线和样品吸光值计算其糖含量。[/font][font=宋体]标准曲线的制作：准确称取[/font]105℃[font=宋体]干燥恒重的标准葡萄糖[/font]50 mg[font=宋体]定容于[/font]500 mL[font=宋体]容量瓶中，加水至刻度，用移液管分别吸取[/font]0[font=宋体]、[/font]0.1[font=宋体]、[/font]0.2[font=宋体]、[/font]0.3[font=宋体]、[/font]0.4[font=宋体]、[/font]0.5[font=宋体]、[/font]0.6[font=宋体]、[/font]0.7[font=宋体]、[/font]0.8[font=宋体]、[/font]0.9[font=宋体]、[/font]1.0 mL[font=宋体]转入试管中，各以蒸馏水补至[/font]1.0 mL[font=宋体]，每个浓度重复四个平行。然后分别向每支试管中加入[/font]4%[font=宋体]苯酚试剂[/font]1mL[font=宋体]及浓硫酸[/font]2 mL[font=宋体]，摇匀，沸水浴中煮沸[/font]10 min[font=宋体]，冷却至室温，放置[/font]10 min[font=宋体]后在[/font]λ= 480 nm[font=宋体]处测定吸光值[/font]A[font=宋体]。以吸光值[/font]A[font=宋体]为纵坐标，糖含量[/font]C[font=宋体]为横坐标，得糖的标准曲线。[/font][font=宋体]样品溶液制备：精密称取水溶性粗多糖[/font]5 mg[font=宋体]，先加[/font]10 mL[font=宋体]蒸馏水溶解，然后定容至[/font]50 mL[font=宋体]。[/font][font=宋体]样品含量测定：用移液管吸取样品液[/font]1.0 mL[font=宋体]，加入[/font]4%[font=宋体]苯酚溶液[/font]1 mL[font=宋体]及浓硫酸[/font]2 mL[font=宋体]，按上述方法进行操作，测其吸光值，以标准曲线计算样品糖含量[/font][font=宋体]按下式计算中草药多糖的质量浓度与得率。[/font] [img=,300,41]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/11/202111021041176368_5305_3528941_3.gif!w300x41.jpg[/img]7.[font=宋体]分级[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）[/font] DEAE-[font=宋体]纤维素的预处理和装柱[/font][font=宋体]将[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素用蒸馏水充分浸泡溶胀后，倾倒除去水分，再用[/font]0.5 M NaOH[font=宋体]溶液浸泡[/font]1 h[font=宋体]，用蒸馏水反复洗涤至[/font]PH[font=宋体]等于[/font]7[font=宋体]。再用[/font]0.5 M[font=宋体]的[/font]HCl[font=宋体]溶液浸泡[/font]1 h[font=宋体]，用蒸馏水洗至中性，真空清除气泡，备用。[/font][font=宋体]装柱时，先将[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素沿着玻璃棒缓慢倒入，以防产生气泡。柱子装好后，依次用[/font]5[font=宋体]倍柱体积的蒸馏水、[/font]3[font=宋体]倍柱体积的[/font]1.0 M NaCl[font=宋体]和[/font]5[font=宋体]倍柱体积的蒸馏水进行平衡，流速设定为[/font]20 cm/ h[font=宋体]。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）水溶性粗多糖的离子交换柱层析的线性梯度洗脱[/font][font=宋体]称取[/font]50 mg[font=宋体]水溶性粗多糖，溶于[/font]5 mL[font=宋体]蒸馏水中，在已平衡好的[/font]DEAE-[font=宋体]纤维素离子交换柱（[/font]1.5 × 14 cm[font=宋体]，[/font]Cl[sup]-[/sup][font=宋体]型）上进行上样，先用[/font]100 mL[font=宋体]蒸馏水做流动相进行洗脱，再用[/font]0~1.0 M NaCl[font=宋体]溶液[/font]300 mL[font=宋体]进行线形梯度洗脱，流速[/font]1.0 mL/min[font=宋体]，每个试管收集[/font]3 mL[font=宋体]洗脱液，苯酚—硫酸法测定洗脱液中相对的糖含量分布。[/font]8.[font=宋体]纯度鉴定[/font][font=宋体]（[/font]1[font=宋体]）高效液相色谱法[/font][font=宋体]采用高效液相色谱仪系统，[/font] 10A[font=宋体]检测器，[/font]CLASS-Vp[font=宋体]工作站，[/font]TSK-gel G-3000PWXL[font=宋体]不锈钢色谱柱（[/font]7.8 × 300 mm)[font=宋体]，柱温为[/font]40℃[font=宋体]。[/font][font=宋体]取各级多糖样品溶于[/font]0.7 M Na2SO4[font=宋体]溶液中，其多糖终浓度为[/font]2 mg/mL[font=宋体]，上样[/font]20 μL[font=宋体]，流动相为[/font]0.7 M Na2SO4[font=宋体]溶液，流速为[/font]0.5 mL/min[font=宋体]。[/font][font=宋体]（[/font]2[font=宋体]）紫外光谱分析[/font][font=宋体]将水溶性粗多糖各级分多糖样品配成[/font]0.1 mg/mL[font=宋体]的溶液，用[/font]752PC[font=宋体]型紫外可见分光光度计于[/font]200-400 nm[font=宋体]处扫描检测。[/font][font=宋体]（[/font]3[font=宋体]）旋光仪分析[/font][font=宋体]不同的多糖具有不同的比旋度，它们在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如同一多糖水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得的沉淀物，具有相同比旋度，则证明该多糖为均一组分。[/font][font=宋体]将评估多糖样品溶于水，成为近似半饱和溶液，置于磁力搅拌器上，在搅拌下加乙醇，使溶液中乙醇浓度达到[/font]20%[font=宋体]，搅拌片刻，使沉淀完全，离心得沉淀。上清液中再继续滴加乙醇，使溶液中乙醇浓度达[/font]40%[font=宋体]，所产生的沉淀再经离心。前后两次沉淀，分别干燥后在相同条件下测定其水溶液的比旋度。[/font][font=宋体]将[/font]10 mL5%[font=宋体]饱和糖液用国产[/font]WXG[font=Symbol]-[/font]6[font=宋体]型自动旋光仪，钠灯光源，以蒸馏水调零点，[/font]1dm[font=宋体]管室温下测定。[/font]