淀粉酶测定仪

α-淀粉酶活性是衡量小麦穗发芽的一个生理指标，为此提出了对小麦α-淀粉酶活性的快速测定方法的研究。α-淀粉酶活性的测定方法有多种，本文仅探讨了常用的3，5-二硝基水杨酸法和凝胶扩散法。结果表明，两种方法的测定结果差异不显著，而且两者呈显著正相关；从变异系数上看，后者的变异程度较低，其精度较高；从误差来源上看，前者引起误差的因素较后者多；后者较为简便快速，准确度较高，重复性较好，可用于大批量样品的分析。关键词: 小麦, α-淀粉酶活性, 3，5-二硝基水杨酸法，凝胶扩散法1 材料和方法1.1 材料和试剂(1)萌芽的小麦：取当年小麦种子，按小麦萌发试验培养，两天后用于测验.(2)1%淀粉溶液.(3)0.4N NaOH.(4)pH5.6的柠檬酸缓冲液：A. 称取柠檬酸20.01克，溶解后稀释至1升；B.称取柠檬酸钠29.41克，溶解后稀释至1升。取A液13.7毫升与B液26.3毫升混匀，即为pH5.6的缓冲液.(5)3,5-二硝基水杨酸: 精确称取3,5-二硝基水杨酸1克溶于20毫升1N氢氧化钠中，加入50毫升蒸馏水，再加入30克酒石酸钾钠，待溶解后，用蒸馏水稀释至100毫升，盖紧瓶塞，勿使二氧化碳进入.(6)麦芽糖标准液：称取麦芽糖0.100克溶于少量蒸馏水中，仔细移入100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度.(7)α_淀粉酶提取缓冲液:20mmol/L醋酸钠（2.7216g/L）,1mmol/L氯化钙（0.11099g/L）,pH 5.5.(8)%5（V/V）碘—碘化钾溶液：1.95gKI+0.65gI2溶解在100毫升蒸馏水中.(9)α_淀粉酶36.18u/mg (Sigma公司)：逐级稀释10, 2.5，0.625 ,0.15625,0.03906, 0.009765mg/mL系列标准液.(10)20%冰乙酸，琼脂糖，可溶性淀粉.1.2 方法1.2.1 3.5一二硝基水杨酸测定法酶液提取从五个培养皿的发芽小麦中，各随机称取1克于研钵中，加少许α_淀粉酶提取缓冲液，研磨至匀浆，倒入离心杯中，于4000rpm离心10分钟,取上清液并并定容至25ml，即为酶提取液，备用。α_淀粉酶活性测定(1)取试管，注明对照管，测定器，每样品三个重复.(2)于每试管中各加酶液1ml，加70℃恒温水浴中加热15分钟，此期间β_淀粉酶受热钝化(3)每管中各加入1毫升pH5.06的柠檬酸缓冲液.(4)对照管中加入4毫升0.4NnaOH.(5)测定管与对照管置40℃水浴中保温10分钟，再向各管加入40℃下预热的淀粉溶液2毫升摇匀，立即放入40℃水浴中准确保温5分钟取出，向各测定管迅速加入4毫升0.4N的氢氧化钠，以终止酶活动.麦芽糖测定取以上各管中酶作用后的溶液及对照管中溶液各2毫升，分别放入25毫升试管中，再加2毫升3，5-二硝基水杨酸，混匀，置水浴中5分钟，冷却后定容至25毫升，混匀，用分光光度计在520nm波长下进行比色记录消光值，取麦芽糖标准液(1ml/mg)0，0.2，0.6 ，1.0，1.4，1.8，2.0ml。按上述同样方法比色后，将测得的消光值与麦芽糖标准液进行直线回归后，代入求得样品的麦芽糖含量，并换算成每克种子α_淀粉酶的活力单位。1.2.2 凝胶扩散测定法凝胶板制备取一长方形优质玻璃，除一宽边外，其余三边边缘各边一条透明胶片，再在上面盖一同等大小玻璃，两块玻璃两侧用夹子固定，放温箱中预热50-60℃，取三角烧杯，加30毫升α-淀粉酶提取缓冲液，0.36克琼脂糖和0.30克可溶性淀粉（作反应底物），在电炉上加热煮沸至透明后，冷却至70℃左右，将预热的玻璃胶片框架斜放在桌面上30℃，用预热的移液管吸取凝胶液，从玻璃架高一端空隙中均匀注入，直至其流遍整个胶片表面为止，不能有气泡。用量约25毫升冷却后形成凝胶板，贮存在4℃冰箱备用。α_淀粉酶活性测定取出预制冷藏的凝胶板，揭开上面一块玻璃，用塑料打孔器在凝胶板上每隔一定距离打一个1.33毫米的孔，用微量移释管向每孔内注入提取液。上述1.2.1制得的酶液于70℃水浴加热15分钟后钝化β-淀粉酶后备用。同时，在每块凝胶板孔中加入淀粉酶系列标准液（重复两次）。将凝胶板置10℃恒温箱中反应24小时后，取出，将胶板浸入I-KI溶液中染色5min,加入冰乙酸酸化终止反应。用蒸馏水淋洗3min，洗净染色液，由于加α_淀粉酶孔周围淀粉被分解，因而染色后出现未能染色的圆。未与α-淀粉酶反应的呈蓝色，用直径测量仪测圆直径。用α_淀粉酶标准液浓度对数与褪色圈直径直线回归，计算每克样品含α-淀粉酶活力单位数。2 结果和分析2.1 两种方法标准曲线2.1.1 麦芽糖标准曲线麦芽糖标准液含量越高，比色后记录的OD值越大，麦芽糖标准液比色后，测得的OD值（ｘ）与麦芽糖浓度（ｙ）进行直线回归，结果为：ｙ=1.0240ｘ+0.0897，r=0.9998，相关系数极显著，表明麦芽糖标准液含量与消光值呈直线关系，通过此直线方程可进一步测得酶活性；即将各样品的消光值代入回归方程，求得样品麦芽糖含量，然后计算可得每克种子的α_淀粉酶活力。2.1.2 α-淀粉酶标准曲线α_淀粉酶标准液浓度越高，其褪色圈直径越大，5个样品的褪色圈直径也有明显差异。将α-淀粉酶标样所测得褪色圈直径（ｘ）与α-淀粉酶浓度对数（ｙ）进行直线回归。结果为：ｙ=2.4659x-3.8994， r=0.9860，相关系数极显著，表明褪色圈直径与淀粉酶标准液的浓度对数呈直线关系，通过此直线方程可进一步测得酶活性，即将各样品的褪色圈直径代入回归方程，求得各样品的α_淀粉酶浓度，然后换算成每克种子中α_淀粉酶的活力单位。2.2 两种方法测定结果比较对5个样品的淀粉酶活性，用两种方法测定，并记录了测定结果（表1）。表1 3，5-二硝基水杨酸法和凝胶扩散法结果 样品 3，5-二硝基水杨酸法 凝胶扩散法 消光值 酶活性 （u/g） 直径 酶活性(cm) （u/g） 1 0.1010 2.191.20 4.03 2 0.1580 6.701.35 6.72 3 0.1460 5.241.27 5.06 4 0.1667 6.961.45 7.14 5 0.1477 5.481.28 5.86对两组样本进行t测验，测定结果为：t=1.2855, t0.05=2.0776,｜t｜r0.05,表明两种结果相关系数显著,即两种方法从其中之一测定结果可以推算出另一方法的测定结果。2.3 两种方法的精度比较表2 两种方法变异数分析结果 方法 平均数（u/g） 标准差(u/g) 变异系数CV(%) 3，5-二硝基水杨酸法 5.314 [

药典胰淀粉酶的测定中2000年版的和2005年版的标准检测所用的碘液浓度分别是0.1mol/L和0.05mol/L，为什么变化这么大呢，检测出来的结果差距也很大，用2000版的测得10万单位的酶活用2005年版才测得5万，而且我发现用2005年版的话空白减样很难控制在2.0-4.0mL之间，谁知道现在测胰酶最新版是哪个版吗，用的碘浓度是0.1的还是0.05的？

在不溶性膳食纤维的测定中，会用到的α-淀粉酶的性状，有人知道不？正常的α-淀粉酶是不是有一股臭脚丫的味道？知道的请回个贴吧，谢谢！[em0808]