二苯甲酰酒石酸

导语2020年山西省运城市垣曲县北白鹅村发现一处古墓，山西省考古研究院等对该处墓地进行了抢救性发掘，经认定这是西周到东周时期召氏家族的墓地。2022年2月12日，中国科学院大学人文学院考古学与人类学系杨益民教授课题组在《Microchemical Journal》期刊发表关于《中国中部北白鹅遗址酒类残留物的表征》的文章。该研究设计了一套GC-MS和HPLC-MS/MS分析疑似古酒残留的综合分析流程，并将其应用于中国中部北白鹅墓地（约公元前8世纪）出土铜壶内的液体和淤泥，研究认为北白鹅遗址出土的这批酒类遗存为非葡萄原料的果酒，这是目前东亚地区经过科学分析确认的最早果酒。研究成果快览山西省运城市垣曲县北白鹅村对于大多数人可能比较陌生，但对于考古届是一个非常著名的地方，早在上世纪50~70年代，这里曾先后发现数十处遗址，这些遗址的年代跨越旧石器时代、新时期时代以及夏商周代。2020年4月12日，山西省考古研究院等对垣曲北白鹅村的一处墓地进行了抢救性发掘，发现两周之际高等级墓葬九座，并初步认定该墓地为召氏家族太保匽中(燕仲)一支在东周王畿内的采邑公共墓地。其中M1、M2、M5等墓葬出土铜壶中含有液体或土样（图1），怀疑是古酒遗存。图1 山西垣曲白鹅墓地出土铜壶及其内部液体和淤泥遗存为确认铜壶内液体残留物的成分组成，中国科学院大学人文学院考古学与人类学系与山西考古院、岛津北京分析中心合作，对M1铜壶内液体残留物、器底土样和M2、M5铜壶器底土样进行取样研究。科研人员建立了一系列标准化测试流程，从液体样品、土样中提取有机残留物，利用气相色谱质谱（GCMS-QP2020NX）检测到乙醇、乙酸、乙酸乙酯等挥发性有机物，并开发出一套利用高效液相色谱-串联质谱（LCMS-8045）快速、准确测试成分复杂的考古样品中多种有机酸的定量方法。图2 中国科学院大学硕士研究生李敬朴在岛津北京分析中心开展部分实验气相色谱质谱仪分析北白鹅墓地铜壶内残留物科研人员从液体样品、土样中提取有机残留物，液体样品采用顶空-气相色谱质谱仪，检测出乙醇等成分。土样样品使用有机溶剂提取后，进行衍生化处理，采用GCMS仪器检测出有机酸、酯、醇酯、糖类等与酒直接相关的物质。图3 岛津气相色谱四极杆质谱仪GCMS-QP2020 NX仪器及其特点图4 BBE-1顶空进样GC-MS分析的TIC谱图（峰2为乙酸乙酯；峰3为乙醇；峰5为乙酸）液相色谱质谱仪分析北白鹅墓地铜壶内有机酸科研人员建立了一种使用岛津三重四极杆液相色谱质谱联用仪LCMS-8045测定考古残留物中的7种有机酸的方法。将液体样品过滤后，用超高效液相色谱分离，三重四极杆质谱仪进行定性定量分析。研究结果显示，垣曲北白鹅墓地铜壶残留物中发现较多的酒石酸、丁香酸、富马酸、苹果酸、琥珀酸、草酸、乳酸等多种有机酸。丁香酸的存在，证实残留物为果酒遗存。通过分析酒石酸的相对含量判断该遗存并非葡萄酒。图 5 岛津超高效液相-三重四极杆质谱联用仪 LCMS-8045及其特点图6 标准样品(混标中酒石酸、丁香酸、苹果酸、琥珀酸、富马酸浓度均为500 ng/mL，乳酸，富马酸浓度为5000ng/mL)的MRM色谱图表1 古代样品、现代参考样品和古代对照样品中七种有机酸的含量专家心声中国科学院大学人文学院考古学与人类学系杨益民教授杨益民教授指出，对古酒残留的鉴定需要对其中的多种有机物进行分析。现代质谱分析技术具有检测信息丰富与对复杂基质样品的高耐受性的特点，特别适合于分析如酒类残留物等有机质考古遗存样品。本研究使用了岛津的GCMS与LCMSMS对北白鹅墓出土的酒类遗存样品进行了检测，实现了对样品中醇类、酯类，特别是有机酸类物质的综合分析，为确认样品为果酒遗存提供了让人信服的证据，这将果酒在中国的历史提前约五百年，改变了过去酿酒史学界关于东亚缺乏果酒酿造传统的观点。参考文献Jingpu Li , Jiyun Yang , Jun Cao , Puheng Nan , Jie Gao , Danshu Shi , BinHan , Yimin Yang *. Characterization of liquor remains in Beibaie site, central China during the 8th century BCE. Microchemical Journal.177(2022)107293.本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

我们大多数人可能都喜欢在闲暇的时候约上三五好友“来两杯”，或在特殊的日子为自己的爱人精心准备一场浪漫的红酒晚餐，亦或只是“我自饮来我自醉”的消遣，但是我们却很少关注并意识到葡萄酒酿造及酿酒工艺的科学。一瓶葡萄酒，从开始种植到酿造装瓶，大约需要生长5年、发酵3个月、橡木桶存放6~18个月，有时甚至还需要在海上运输2~3个月，毫无疑问，这是一门需要时间和耐心的技艺。在葡萄培育和酿酒工艺中，科学培育出优良的葡萄品种、改进酿造工艺、提升质量都是至关重要的环节，而这需要借助先进的科学手段和工具，扫描电子显微镜（SEM）作为一种超高分辨率的微观观测和分析的工具，在葡萄酒酿造产业中也“大有用武之地”！扫描电镜可从细胞、亚细胞水平乃至生物大分子水平对各种样品进行深入细致的分析观察。通过观察研究葡萄树的叶片、花朵、果实等的形态结构，可对葡萄品种选育、种植管理、采摘储藏等生产环节提供重要参考；通过观察分析发酵过程中原料、菌种、发酵产物等的状态和性质，可以帮助研究人员改善发酵工艺，分析生产中遇到的实际问题。图：由TESCAN合作发布的利用电镜研究葡萄培育和葡萄酒酿造工艺的相关文章入选《Lab+Life Scientist》期刊封面为了培育出优良的葡萄品种，研究人员需要借助高分辨率的扫描电子显微镜观察不同组织、器官的形貌结构（如植物表皮细胞组织、维管组织、气孔等），寻找优良植株的内在原因，最终培育成需要的品种。图：葡萄藤死表皮组织细胞的表面形貌（注：使用TESCAN MIRA3 FE-SEM在高真空下观察）图：在显微镜下观察到淀粉颗粒（绿色）沉积在葡萄藤的维管组织中（注：研究使用了TESCAN FE-SEM与冷冻传输系统对样品进行冷冻固定、冷冻断裂并保持在冷冻下观察，以获取样品的真实形貌。冷冻电镜方案特别适用于脆嫩的植物组织及一些冷冻下才能稳定保存的样品，如冰激凌等。）在具有超高分辨率的电子显微镜下，还可以清晰地观察到葡萄叶的形态细节以及位于葡萄叶表面的气孔。气孔在植物碳同化、呼吸、蒸腾作用等气体代谢中，成为空气和水蒸气的通路，在生理上具有重要的意义。图：葡萄叶及其表面气孔的微观形貌细节（注：样品使用化学固定、脱水及临界点干燥处理）酵母菌在葡萄酒酿制中是不可缺少的。简单来说，酿酒酵母就是一种单细胞微生物，可以将葡萄中的糖分转变为酒精，也就是俗称的酒精发酵。为了培养、识别出优质的酵母，研究人员需要通过观察菌种的大小、形貌等细节来辨识不同菌种。酒香酵母（Brettanomyces），是一种在酿酒过程中随时可能出现的物质，它因为能够为葡萄酒增加“香味”，而被人铭记。适量的酒香酵母可以为葡萄酒增添风味，但过量存在时则会使葡萄酒散发出一种类似“臭袜子”或“马骚味”的气味，破坏酒的气味和口感。图：电子显微镜下观察到的酒香酵母细胞（注：样品使用化学固定、脱水及临界点干燥处理） 另外，在葡萄酒酿造中，还会产生一种副产品—酒石酸氢钾。这是一种无色至白色的斜方晶系结晶性粉末，无臭，有令人愉快的清凉酸味，通常被食品工业称作塔塔粉。但在酿酒过程中，产生的酒石酸氢钾会与酵母细胞结晶产生浑浊的细白色或淡黄色沉淀物，这些沉淀物虽然不会影响葡萄酒的味道或气味，但它会影响葡萄酒的美感。图：肉眼观察到的的酒石酸氢钾图：电子显微镜下的酒石酸氢钾与附着在其表面的酵母细胞（注：酒石酸氢钾易溶于水，样品不能用常规制样方法，例如化学固定，因此使用TESCAN MIRA3 FE-SEM低真空功能直接进行观察。TESCAN的低真空功能特别适用于不导电样品的直接观测及电子束下不稳定的生物样品。）在葡萄酒发酵成熟时，酒液中也会有残留的死酵母、杂质、葡萄残渣以及部分酒石酸结晶，这些物质会沉淀形成酒泥。因此，在装瓶前，酿造者通常会使用“倒桶”、过滤或下胶澄清、冷却结晶等方式去除这些沉淀物，来保证葡萄酒的“美感”。图：在电子显微镜下观察葡萄酒的澄清过滤（过滤孔筛的孔隙范围为0.45~1.2μm）（注：使用TESCAN水汽注入系统可直接观察样品，保持样品最原始的状态。水汽注入系统特别适用于易失水的生物样品及水汽参与反应的原位实验，如食盐溶解与重结晶、水泥固化等）以上图像及数据来自于由全球扫描电子显微镜的领先制造商TESCAN与捷克国家葡萄酒中心合作开展的一项研究，该项研究利用超高分辨扫描电子显微镜探究葡萄培育和葡萄酒的酿造工艺。这项研究工作在TESCAN MIRA3超高分辨场发射扫描电镜（FE-SEM）上完成，在本研究中使用的样品由位于布尔诺的孟德尔大学的葡萄培育和葡萄栽培部提供。目前，相关研究成果已在捷克国家葡萄酒中心公开展览，展览地设在著名的Valtice城堡的总部，该城堡也被联合国教科文组织列为世界遗产地。图：在捷克葡萄酒酒都Valtice城堡展出的“特殊展览” 该项研究的合作和技术支持—TESCAN公司的总部位于捷克布尔诺市，该地区被称为欧洲电子显微镜的摇篮。布尔诺也是捷克共和国南部与奥地利和斯洛伐克接壤的摩拉维亚地区的首府，这里是捷克主要的葡萄酒产区，占其国家总产能的96%。捷克国家葡萄酒中心主任Pavel Kr?ka谈到：“据我们所知，这个展览是同类型展览中的第一次，展览非常受欢迎。参观者们被这些图像所震撼，因为这个展览在吸引葡萄酒爱好者，传播葡萄酒文化的同时，还为参观者展示了葡萄酒种植及酿造相关的科学内容！“

p 　　一杯红酒，一盏甘醇，葡萄酒的品鉴既是一门艺术，也是一门科学。葡萄酒的主要成分是水和酒精，除此之外，还含糖和甘油(均为发酵的残留物)，酸类物质，包括单宁在内的多酚类物质，以及其他更少量的酯类等。葡萄酒的香气主要来自于其中的酯类，而口感则主要由其他的物质决定。比如，糖类影响其甜度，酸类影响其酸度，多酚类物质产生苦涩感，而甘油赋予了葡萄酒厚度。这些成分及其含量综合决定了葡萄酒的口感。 /p p 　　除了视觉、嗅觉和味觉的体验，科学研究如何从数据上分析葡萄酒组成?红外光谱给出了其特有的品鉴方式! /p p 　　红外光谱法，基于化合物官能团振动过程中偶极矩变化产生的特征吸收，为不同的化合物提供了特定的红外光谱特征，被形象的称作“指纹图谱”，既可定性，还可定量。譬如，酸类物质的特征官能团是羰基，红外峰在1710cm sup -1 /sup 左右 多酚类物质的特征官能团是多个共轭苯环，红外峰在1610cm sup -1 /sup 左右 糖和甘油的特征官能团是C-O，红外峰在1000cm sup -1 /sup 左右。这些谱峰的吸光度，同其含量成正相关。由此可见，葡萄酒影响口感的化合物都有红外特征，因此可使用红外光谱法分析葡萄酒组成。 /p p 　　BCEIA互动体验区，珀金埃尔默现场演绎了红外光谱分析葡萄酒组成的过程，吸引了很多业内人士围观。实验中，使用移液枪精确将2µ l的葡萄酒滴在Spectrum Two红外光谱仪的ATR附件的金刚石晶体上。约5分钟后，酒精和水挥发完毕，剩余的化合物附着在晶体表面，即可启动扫描程序，采集ATR红外光谱。图1右是某品牌赤霞珠葡萄酒的ATR红外谱图，可以明显的看到其酸类、多酚类、糖和甘油的特征。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 269px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/dea48f7b-ae05-45e4-a60c-1159d81f730b.jpg" title=" 微信图片_20191024233830.png" alt=" 微信图片_20191024233830.png" width=" 600" height=" 269" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 图1. 左: PerkinElmer Spectrum Two红外光谱仪，将葡萄酒样品滴加在晶体上即可进行检测。右：某品牌赤霞珠葡萄酒的红外光谱图，显示了其酸类、多酚类、糖和甘油等物质的特征 /strong /p p 　　葡萄酒中的各类物质并不是单一的，而是由很多成分组成。譬如，柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸等是常见的酸类 白藜芦醇、花青素、槲皮素、原花青素等是常见的多酚类 葡萄糖、蔗糖、果糖等是常见的糖类 而单宁实际上也是一种酸，但具有多酚的结构。这些成分的红外特征又不相同。图2为常见糖类和甘油的红外谱图。虽然他们的主要官能团类似，但具体结构的差异还是体现了特征红外光谱。因此，可通过进一步分析，获得葡萄酒各类成分更细节的组成和含量信息。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 403px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/45d64869-0666-42b4-9942-656698927a1f.jpg" title=" 22.jpg" alt=" 22.jpg" width=" 500" height=" 403" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 图2. 葡萄酒中主要糖类和甘油的红外谱图 /strong /p p 　　红外光谱法不会对葡萄酒本身的化合物产生干扰，会如实体现其真实的光谱特征。譬如果糖就可以直观的观测到其红外特征，而色谱方法分析时需要将果糖还原成葡萄糖从而无法检测到真实的糖类成分。如图3，在1000cm sup -1 /sup 左右的糖和甘油的光谱峰区间，只有坤爵桃红葡萄酒有明显的果糖特征，而其他的赤霞珠、西拉、美乐、雷司令等只有甘油的特征，完全符合这些干红葡萄酒的含糖量低的特点。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 500px height: 403px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/46fe39cf-13fb-4b0f-993c-0ad153606d28.jpg" title=" 33.jpg" alt=" 33.jpg" width=" 500" height=" 403" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: center " strong 图3.坤爵桃红葡萄酒的红外谱图体现了其果糖成分的光谱特征，而其他干红葡萄酒则主要是甘油的光谱特征 /strong /p p 　　综上可见，红外光谱法可以体现出影响葡萄酒口感的各种化合物的种类和含量的信息，因此“红外光谱品葡萄酒”是一个切实可行的方法，其将比较主观的品酒师品酒变成谱图显示的红外品酒，更直观也更可量化。 /p p 　　在BCEIA互动展区，有不少专家和观众都对这种方法产生了浓厚的兴趣。大家纷纷反映，这种方法可以将市场上勾兑的劣质酒和假酒同真正的酿造葡萄酒区分开，而不会再良莠不分。北京大学刘锋教授仔细了解了这种方法后，也表示认同，她认为这种方法快速、客观、直接，在葡萄酒品牌保护、葡萄酒质量分级、葡萄酒工艺改进等方面都可以发挥重要作用。甚至，她还提出了可以使用大数据方法将葡萄酒的销售趋势、购买人群同葡萄酒的红外光谱建立联系，从而为企业预期生产安排、精准投放广告、迎合市场口味等方面作为重要参考。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 300px height: 225px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/c3c42544-b1b0-4123-aaf1-2d2e8cc611c1.jpg" title=" 4.1.jpg" alt=" 4.1.jpg" width=" 300" height=" 225" border=" 0" vspace=" 0" / img src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201910/uepic/037af2b5-68e0-4de3-8d13-c20045a110f3.jpg" title=" 4.2.jpg" alt=" 4.2.jpg" width=" 300" height=" 225" border=" 0" vspace=" 0" style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 300px height: 225px " / /p p style=" text-align: center " 图4. 专家对“红外光谱品葡萄酒”技术很感兴趣，纷纷点赞 /p p 　 strong 　仪器评议专家： /strong /p p 　　郑国经教授 首钢北京冶金研究院 /p p 　　符斌教授 矿冶总院测试所 /p p 　　高介平教授 矿冶总院测试所 /p p 　　刘锋教授 北京大学 /p p 　　辛仁轩教授 清华大学 /p p 　　周群副教授 清华大学 /p