尼拉帕尼代谢物

目的使用ACQUITY UPLC／Xevo&trade G2 QTof质谱系统及MetaboLynx&trade XS应用管理软件，鉴定通过人肝微粒体体外孵育而获取的1 &mu M维拉帕米的代谢物。 背景近年来，随着越来越多的一线药品因存在安全性顾虑而退出市场，人们对药品研发过程中的药物代谢和毒性研究给予了更多的关注。如今，在药物发现和研制阶段提早进行药物代谢研究的趋势已比较明显。普遍的做法是对母体药物进行体外代谢物研究，以便在药品开发早期迅速确定其弱点。 在药物发现阶段进行代谢物鉴定的一项挑战是：需要提供快速而通用的方法，并且该方法应足够灵敏，以使体外孵育研究可在低&mu M浓度水平下进行，从而使其更接近于化合物的体内作用情况。 一项典型的体外代谢研究还包括分析母体药物的代谢速率和途径。此类研究的理想分析方案需提供在模拟体内条件的底物浓度下对代谢物进行检测的分析速度和灵敏度。 利用与UPLC/MSE联用的Xevo G2 QTof质谱系统，体外代谢物研究可在低&mu M水平下进行，同时具有较好的速度、灵敏度和选择性。 图1. 人肝微粒体维拉帕米（1 &mu M）的孵育结果显示在MetaboLynx浏览器 中。 解决方案将浓度为1 &mu M的维拉帕米与人肝微粒体在37° C下进行孵育，并分别在 0、15、30、60、120和 240分钟时加入等体积的冷乙腈终止反应。对样品进行离心，并取上清液直接进样。 【 技 术 概 要 】 采用沃特世ACQUITY UPLC系统，ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（1.7 &mu m、2.1 x 100 mm），进行色谱分离。流动相由0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B）组成，进样量为5.0 &mu L。在ESI正离子模式下，使用Xevo G2 QTof质谱仪采用UPLC/MSE技术进行数据采集，这样一次进样即可同时获取母离子和产物离子的数据。 MetaboLynx XS应用管理软件用于进行数据挖掘，结果显示在MetaboLynx浏览器中（如图1所示）。产物离子信息同时进行处理，并显示在MetaboLynx浏览器中的碎片分析窗口内（图2）。通过对多个孵育时间点的样品进样分析，母体药物的清除曲线和代谢物的形成曲线可在同一次试验中同时获取（如图3所示）。 总结这个应用表明：通过使用配备UPLC/MSE 和MetaboLynx XS工作流程的Xevo G2 QTof质谱系统，体外代谢物研究可在低浓度（&mu M）水平下进行，同时具有较好的速度、灵敏度和选择性。 Xevo G2 QTof系统及其创新型QuanTof&trade 和Engineered Simplicity&trade 技术，与ACQUITY UPLC系统实现了完美结合。它是目前最灵敏的台式oaTOF仪器，拥有1 ppm的准确质量测定能力，数据采集速度高达每秒20张光谱图。 通过采用UPLC/MSE 数据采集策略，再加上具有化学智能的MetaboLynx XS数据处理工作流程，只需进行一次液相色谱进样即可快速完成所有代谢物的鉴定工作。通过在多个时间点进样，可比较容易地获取低浓度（&mu M）孵育水平下目标药物的代谢速率和途径。因此，产能最大化的目标即可轻松实现。

p　strong　仪器信息网讯/strong 2016年5月6日，由中国科学院大连化学物理研究所代谢组学研究中心与大连达硕信息技术有限公司联合主办的代谢组学研究最新进展与代谢物鉴定分析交流会通过仪器信息网网络讲堂平台顺利举行。/pp　　本次会议采取了网络直播与现场会议相结合的模式，300多名用户报名参加了在线的网络直播会议，同时有近50名来自有大连理工大学、黑龙江中医药大学等高校的研究人员在大连化物所参加了现场会议。/pp　　据介绍，本次交流会的举行主要是为了庆祝OSI/SMMS 代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统开发完成。该系统由大连达硕信息技术有限公司与中国科学院大连化学物理研究所代谢组学研究中心共同开发完成，基于近2000个标准化合物，4个主流网络数据库，以及用户自建数据库，可实现代谢物的快速、批量、准确定性分析。/pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="会议直播.jpg" style="HEIGHT: 347px WIDTH: 500px" border="0" hspace="0" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201609/insimg/dc5e6755-def3-4ad1-b27d-8b13c1d917d8.jpg" width="500" height="347"//pp style="TEXT-ALIGN: center"img title="许国旺2c.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201605/insimg/606abeb9-aeb1-45dc-937f-46d81e32daad.jpg"//pp　　会议中，中国科学院大连化学物理研究所代谢组学研究中心许国旺研究员首先从代谢组学概述、代谢组学研究方法、代谢组学应用的新进展、前景展望等四个方面对代谢组学做了详细介绍。/pp　　代谢组学是研究生命体对于内在基因突变、病理生理变化以及外在环境等因素刺激作用下的体内的动态多元的代谢物响应，定性定量描述生物体内所有内源性代谢物。与其他组学相比，基因及环境因素改变而引起的变化在代谢组上体现的更为显著，并且代谢组变化快速、使得其对环境变化的应答更为及时灵敏，对于发现实际表型变化前的早期代谢扰动具有重要的潜力。目前，代谢组学在疾病、植物、肠道菌群、药物研发、食品等领域都有应用。/pp　　许国旺在报告中提到“基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生了什么，而代谢组学则可以告诉你已经发生了什么，疾病变化往往在代谢组中能更早的体现出来，因而在早期疾病诊断中更具优势。”/pp　　对于代谢组学的未来的发展，许国旺介绍说如何更好的表征代谢物，拓展代谢组学的分析能力，从而促进代谢组学在生化医学领域的应用是大家所关注的，如进行规模化代谢物鉴定，提高对所获取代谢物信息的利用率 高通量分析，应对大规模代谢组学分析 提高对低丰度代谢物信息的利用 由经典的表型发现向功能表征推进等。/pp　　大连达硕信息技术有限公司总经理曾仲大博士在会议中介绍了OSI/SMMS 代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统的开发背景，需要解决的主要问题，采取的解决方案和关键技术，以及相应的应用实例。/pp　　曾仲大介绍说代谢物的鉴定是后续深度生物解释的基础和前提。而目前普遍认为，常规方法(主要指LC-MSsupn/sup、GC-MS和NMR)能检测和鉴别的代谢物应不到样品中代谢物总量的10-15%。一次常规的代谢组学血液分析，在所获得了成千上万质谱特征中，往往仅能鉴定出几十至上百种代谢物，且大多数情况下并没有验证其准确性。/pp　　OSI/SMMS 代谢组学小分子化合物快速鉴定分析软件系统融合多级质谱的精确质量数与保留时间信息，实现未知代谢物的多层次鉴定分析。该软件的特色在于快速、准确的实现未知代谢物定性，减少繁复的操作步骤，降低对使用者的要求。它拥有信息完备的自建标准数据库、集成了主流网络数据库、采用先进的定性匹配算法、能够实现多层次未知物定性，可实现定性经验的传递，以及丰富的数据库功能。/pp　　本次会议得到了用户的充分认可，会后仪器信息网的网友们通过多种渠道对许国旺研究员和曾仲大博士带来的精彩报告表示感谢。错过会议的网友们可查看本次网络讲座的视频回放，了解报告详细内容。请见链接：a href="http://www.instrument.com.cn/webinar/Video/play/103101"http://www.instrument.com.cn/webinar/Video/play/103101/a/p

代谢表型分析在临床和流行病学研究方面都有着很大的帮助，通常使用质谱来完成这一工作，用于高通量和稳定的测量疾病相关的代谢物。传统的定量分析使用三重四级杆的方法，但这种方法缺乏发现新的代谢物的能力。因此，Jeremy K. Nicholson团队1于2021年在《Talanta》上发表了《Asimultaneous exploratory and quantitative amino acid and biogenic amine metabolic profiling platform for rapid disease phenotyping via UPLC-QToF-MS》，提出了一种基于高分辨质谱（HRMS）的工作流程，在定量34中氨基酸及其他生物胺类代谢物的同时，还可进行全扫对未知代谢物进行探索。本研究使用三种人类体液（血浆，血清和尿液）对比了高分辨QTOF和传统QQQ的定量结果，发现两者准确度和精密度相当，且线性良好。将该方法扩展应用于SARS-CoV-2阳性患者和健康组血浆样本的对比分析，QQQ和QTOF均可实现两类样本的正确分类。重要的是，QTOF的全扫描数据可回溯分析，对34个目标定量物质之外的其他的感兴趣的生物标志物进行定量分析。实验设计QQQ和QTOF使用同样的液相条件，QQQ使用MRM扫描模式，QTOF使用bbCID扫描模式。QTOF使用的为布鲁克的impact II。两种仪器对比时线性，精度度和准确性，特异性等计算判断方法依据FDA和EMA生物分析指南进行。日内稳定性通过在一天内多次重复分析不同浓度的QC样本进行，日间稳定性在三天内分析不同浓度的QC样本并进行对比。实际样本的对比，进行了两组实验。第一组比较了两种不同仪器平台，定量人体血浆，血清和尿液样本中34种目标代谢物的结果。第二组使用两种质谱分析SARS-CoV-2感染者和健康人群样本，并进行统计学分析。结论线性和特异性QTOF和QQQ均能在1-400umol/L范围内实现良好线性，相关系数大于0.99，残差小于15%。表明QTOF在所需浓度范围良好的定量能力。QQQ一般情况下，会选择一个定性离子和一个定量离子来确证目标化合物并进行定量。但当目标化合物有背景干扰时，可能需要改变其定性离子来确证化合物，或者在样本前处理/色谱分离过程除去干扰。但高分辨QTOF可以使用高精度的窄窗口实现化合物筛选和定量。下图给出了一个相关的例子，分析尿液中的精氨酸时QQQ受到背景杂质干扰，但QTOF并不会。准确度和精密度对比了两台QTOF，三台QQQ的日间和日内精密度。根据欧洲生物分析论坛关于血浆代谢物分析的提议，我们的检测验证的预定义接受标准是四个不同浓度的QC样本的三次重复的平均偏差和CV为20%。图2显示了对NISTSRM1950样本中部分氨基酸定量结果日间精密度的雷达图。不同平台仪器对比为了评估本研究中五台仪器上实际样品的定量结果之间的一致性，对12个血浆、血清和尿液样品的氨基酸定量结果进行了比较。图3所示的相关矩阵表明，两类仪器平台的实际血浆样品中氨基酸的计算浓度之间高度一致，相关系数0.849.PCA分析PCA是代谢分析中常用的分析方法，用于对大批量数据的统计学分析。这里，我们使用PCA对34种氨基酸及生物胺类化合物进行分析，这34种代谢物在之前的文章中被验证为SARS-CoV-2感染引起相关变化的代谢物。图4给出了QQQ和QTOF数据PCA的结果。两类仪器均可明显区分健康组和感染组。区分健康对照组和COVID-19感染者的能力证明了该方法对COVID-19进一步研究的价值。QTOF同时定性和定量分析使用QTOF相比于QQQ最大的优点是数据采集过程中能最大程度的保留样本的信息，尤其是在样本非常珍贵的情况下，只需一针进样，就可以同时进行定性和定量分析。不仅可以进行靶向分析，还可进行非靶向目标物的分析。非靶向的分析可通过MetaboScape软件实现。在刚才的样本分析中，QTOF的全扫共扫描到2700多个特征峰，而QQQ只能扫描目标的34个化合物。这2700个特征峰中，存在很多潜在的标志物，使用QTOF可以对这些标志物进行定性和定量。下图给出了分析的相关示例。参考文献Nicola Gray, Nathan G. Lawler, Rongchang Yang, Aude-Claire Morillon , Melvin C.L. Gay, Sze-How Bong, Elaine Holmes, Jeremy K. Nicholson, Luke Whiley. "A simultaneous exploratory and quantitative amino acid and biogenic amine metabolic profiling platform for rapid disease phenotyping via UPLC-QToF-MS", Talanta 223 (2021) 121872.