推荐厂家
暂无
暂无
金黄色葡萄球菌及检验 一、生物学特性 典型的金黄色葡萄球菌为球型,直径0.8μm左右,显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽胞、鞭毛,大多数无荚膜,革兰氏染色阳性。金黄色葡萄球菌营养要求不高,在普通培养基上生长良好,需氧或兼性厌氧,最适生长温度37°C,最适生长pH 7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起,直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性,可在10-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖,产酸不产气。甲基红反应阳性,VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸,水解尿素,还原硝酸盐,液化明胶。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力,对磺胺类药物敏感性低,但对青霉素、红霉素等高度敏感。二.流行病学 金黄色葡萄球菌在自然界中无处不在,空气、水、灰尘及人和动物的排泄物中都可找到。因而,食品受其污染的机会很多。近年来,美国疾病控制中心报告,由金黄色葡萄球菌引起的感染占第二位,仅次于大肠杆菌。金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题,在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占45%,我国每年发生的此类中毒事件也非常多。金黄色葡萄球菌的流行病学一般有如下特点: 季节分布,多见于春夏季;中毒食品种类多,如奶、肉、蛋、鱼及其制品。此外,剩饭、油煎蛋、糯米糕及凉粉等引起的中毒事件也有报道。上呼吸道感染患者鼻腔带菌率83%,所以人畜化脓性感染部位常成为污染源。一般说,金黄色葡萄球菌可通过以下途径污染食品: 食品加工人员、炊事员或销售人员带菌,造成食品污染;食品在加工前本身带菌,或在加工过程中受到了污染,产生了肠毒素,引起食物中毒;熟食制品包装不严,运输过程受到污染;奶牛患化脓性乳腺炎或禽畜局部化脓时,对肉体其他部位的污染。 肠毒素形成条件: 存放温度,在37°C内,温度越高,产毒时间越短; 存放地点,通风不良氧分压低易形成肠毒素; 食物种类,含蛋白质丰富,水分多,同时含一定量淀粉的食物,肠毒素易生成。三.致病性 金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌,可引起局部化脓感染,也可引起肺炎、伪膜性肠炎、心包炎等,甚至败血症、脓毒症等全身感染。金黄色葡萄球菌的致病力强弱主要取决于其产生的毒素和侵袭性酶:a.溶血毒素:外毒素,分α、β、γ、δ四种,能损伤血小板,破坏溶酶体,引起肌体局部缺血和坏死;b.杀白细胞素:可破坏人的白细胞和巨噬细胞;c.血浆凝固酶:当金黄色葡萄球菌侵入人体时,该酶使血液或血浆中的纤维蛋白沉积于菌体表面或凝固,阻碍吞噬细胞的吞噬作用。葡萄球菌形成的感染易局部化与此酶有关;d.脱氧核糖核酸酶:金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶能耐受高温,可用来作为依据鉴定金黄色葡萄球菌;e.肠毒素:金黄色葡萄球菌能产生数种引起急性胃肠炎的蛋白质性肠毒素,分为A、B、C、D、E及F五种血清型。肠毒素可耐受100°C煮沸30分钟而不被破坏。它引起的食物中毒症状是呕吐和腹泻。此外,金黄色葡萄球菌还产生溶表皮素、明胶酶、蛋白酶、脂肪酶、肽酶等。
一、金黄色葡萄球菌及其肠毒素 葡萄球菌属(Staphylococcus)至少包括有20个种。其中金黄色葡萄球菌是一种引起人类和动物化脓感染的重要致病菌,也是造成人类食物中毒的常见致病菌之一,可引起许多严重感染。本菌广泛分布于自然界,如空气、土壤、水及其它环境中。在人类和动物的皮肤及外界相通的腔道中也存在次菌。1.病原学特征 革兰氏阳性球菌,直径为0.8-1.0μm,成对或成短链状排列,或呈葡萄状聚集,无芽孢,无鞭毛(见图6-6)。 图6-6 金黄色葡萄球菌显微形态结构 file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps_clip_image-28057.png file:///C:/DOCUME~1/ADMINI~1/LOCALS~1/Temp/ksohtml/wps_clip_image-27880.png 不能运动,一般不形成荚膜,但在少数菌株的外层可见有荚膜样的粘液物质。需氧或兼性厌氧菌,营养要求不高,于普通培养基上生长良好,37℃孵育24~48h形成直径1~2mm圆形、隆起、表面光滑、湿润、有光泽、不透明、边缘整齐的菌落。在室温下长时间培养产生脂溶性色素,使菌落呈金黄色。于血液琼脂平板上培养,金黄色葡萄菌菌落周围可形成完全透明溶血环(β溶血)。在液体培养基中呈混浊生长。生长温度在6.5-46℃之间,最适温度为30-37℃,能在冰冻环境下生存,能在质量分数为15%NaCl和40%胆汁中生长。在水分活度为0.87的条件下仍能存活。分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,产酸不产气。分解甘露醇产酸在鉴定致病性方面有一定意义。 在不形成芽胞的细菌中金黄色葡萄球菌抵抗力最强。于干燥的脓汁或痰液中可存活2~3个月;加热60℃1h或80℃30min才能将其杀死。在2%石炭酸中15min或在0.1%升汞中10-15min死亡。耐盐,在含有10%~15%NaCl的培养基中仍能繁殖。对某些染料较敏感。如1︰10-20万倍稀释的龙胆紫溶液能抑制其生长。对青霉素、金霉素、红霉素和庆大霉素高度敏感,对链霉素中度敏感,对万古霉素也敏感;但对磺胺、氯霉素敏感性差。近年来由于抗生素的选择作用,耐药菌株逐年增多,尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)已成为医院内感染最常见的致病菌。 金黄色葡萄球菌可通过化脓性炎症的病人或带菌者在接触食品后,使食品污染。金黄色葡萄球菌在20~37℃及适宜的pH和合适的食品条件下能产生肠毒素,如被金黄色葡萄球菌污染的食物,通常在21~30℃下,放置3~5h,就能产生足以引起中毒的肠毒素。50%以上的金黄色葡萄球菌可产生肠毒素,并且一个菌株能产生两种以上的肠毒素,引起食物中毒的肠毒素是一组对热稳定的低分子量可溶性蛋白质,分子量为26000-30000。 常用噬菌体分型。目前国际上将金黄色葡萄球菌分为4个噬菌体群、23个噬菌体型。噬菌体分型可用于流行病学调查按抗原性可分为A、B、C1、C2、C3、D、E、F共8个血清型且均能引起食物中毒,尤以[font=Ti
高效液相色谱法对金黄色葡萄球菌肠毒素B的快速分离纯化与检测 以金黄色葡萄球菌肠毒素为代表的一类蛋白质可以导致人类及其他灵长类动物的呕吐和腹泻,本实验开发了一种两步高效液相色谱法快速纯化金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)的方法,首先将无菌的滤液通过反相色谱柱进行吸附,通过一个梯度洗脱的溶剂系统获得SEB,首先采用含有醋酸铵的乙腈水溶液洗脱,然后再用三氟乙酸(TFA)水溶液洗脱,以除去其他杂质。随后用含有TFA的乙腈水溶液将吸附的SEB洗脱下来。样品再经过阳离子交换色谱柱进行纯化。本方法可以得到初始滤液中40%-50%的SEB,通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离免疫印迹法分析表明,经HPLC纯化的SBE免疫性质和生化性质同标准的SEB相似。 金黄色葡萄球菌肠毒素为金黄色葡萄球菌的某些菌株产生的一类蛋白质,能引起人类及其他灵长类动物的食物中毒反应,症状以呕吐和腹泻为主。根据血清特异性抗体反应将他们分为几类:金黄色葡萄球菌肠毒素A(SEA),SEB,SEC,SED,SEE等9个型。除了能引起食物中毒,还有超抗原作用,能够提高内毒素休克的风险。SEA,SEB,SEC这三种毒素的理化性质(包括分子大小,碱基序列,基本结构)已经被广泛研究。金黄色葡萄球菌肠毒素具有相似的结构,具有单个多肽链和一个二硫键。 文献中金黄色葡萄球菌肠毒素的纯化一般是阳离子交换色谱与凝胶色谱交替使用的多步骤过程。这些步骤主要用于色谱或电泳中纯毒素单个蛋白质分析,对于金黄色葡萄球菌肠毒素分子模式的了解对于我们了解其在发病中的作用非常重要。这些结构与功能的研究也为我们更加简单和快速的纯化和分析毒素提供了参考。材料和方法:金黄色葡萄球菌株S6的培养粗滤液作为SEB的初始来源,菌株S6是SEB的高产菌株。菌株在1L的培养液(包含有1%的蛋白胨,0.5%的酵母提取物,0.5%的NaCI)中培养,并于37℃条件下摇床培养24小时。通过离心(6000转/min,30min)获得除菌后的培养液,然后经过0.45um滤膜过滤得到滤液。色谱条件:分析性高效液相:安捷伦液相1200,菲罗门液相色谱柱4.6﹡150﹡5u,流速:0.8ml/min,进样量1ml,http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301407_516501_2206222_3.png制备型高效液相:大连依利特,色谱柱SinoChrom ODS-AP ,10μm20*250mm;流速:20ml/min;制备型阳离子色谱柱为TSK-GELG3000SWXL5μm,7.8×300m流动相A:0.01 M醋酸铵pH值=5.5;;流动相B为乙腈;流动相C为0.1%三氟乙酸(TFA);流动相D为乙腈含有0.1%TFA。试剂均为色谱纯。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301408_516502_2206222_3.png制备色谱图如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301409_516503_2206222_3.jpg制备第二步:制备型阳离子色谱柱为TSK-GELG3000SWXL5μm,7.8×300mhttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301410_516505_2206222_3.png制备色谱图如下:http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2014/09/201409301409_516504_2206222_3.jpg纯化后的样品于12%聚丙烯酰胺-SDS凝胶中进行电泳,电泳后进行染色或蛋白质印迹分析结果与讨论:本试验探索出一条高效液相色谱法对金黄色葡萄球菌肠毒素B的分离纯化方法,效果明显。