氯化异丁基化甲基化二甲氧基硅烷

近日，中国科学院大连化学物理研究所生物分离分析新材料与新技术研究组研究员叶明亮团队和上海有机化学研究所生物与化学交叉研究中心研究员刘聪团队合作，将硼酸化学引入到甲基化蛋白质组分析方法中，并巧妙利用精氨酸残基上不同修饰基团的位阻差异，实现高效的精氨酸二甲基化肽段富集，显著提高了蛋白质甲基化的分析能力；利用此新方法，系统分析了蛋白质分相过程中精氨酸二甲基化的变化，揭示了此类修饰的发生会降低蛋白质的分相能力。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种调控蛋白质功能的重要翻译后修饰，与较多疾病的发生发展相关。研究表明，精氨酸二甲基化会影响一些神经退行性疾病相关蛋白的液-液相分离，以及相分离所驱动的无膜细胞器的产生。然而，受限于目前精氨酸二甲基化蛋白质组分析技术覆盖率不足，这类研究仅聚焦于少数几个蛋白，尚未系统性探究精氨酸甲基化对蛋白质相分离的影响。　　本研究发现，不同甲基化修饰的精氨酸残基在与邻二酮类化合物反应时，由于位阻不同，反应活性差异巨大。合作团队据此设计了一种精氨酸二甲基化肽段的富集方法：先利用环己二酮选择性的封闭无修饰精氨酸残基，随后利用丙酮醛选择性的在二甲基化精氨酸残基上修饰顺式邻二羟基，从而使得硼酸材料可以选择性的富集精氨酸二甲基化肽段。相比传统的免疫亲和富集方法，该方法拥有较强的精氨酸二甲基化肽段富集能力，特别是在鉴定RG/RGG序列上的精氨酸二甲基化位点方面有更高的灵敏度。合作团队将该方法应用于分析蛋白质相分离过程中精氨酸甲基化的变化，发现包括G3BP1，FUS，hnRNPA1、KHDRBS1在内的一些与无膜细胞器或神经退行性疾病相关的蛋白质上的精氨酸二甲基化程度发生了显著变化；系列实验验证发现，精氨酸甲基化会显著降低这些蛋白质的分相能力，且上述蛋白质组分析中鉴定到变化的甲基化位点是调控蛋白质相分离的关键因素。本工作开发了基于化学反应的精氨酸二甲基化蛋白质组分析方法，并利用这一方法揭示了精氨酸二甲基化对蛋白质液-液相分离具有重要的调控作用。　　叶明亮团队致力于蛋白质磷酸化、糖基化、甲基化等翻译后修饰分析新方法的研究，发展了基于可逆酶促化学标记的O-GlcNAc糖肽无痕富集方法，克服了标记基团对糖肽质谱检测的干扰，实现了O-GlcNAc糖基化的高灵敏分析（Angew. Chem. Int. Edit.）；利用不同糖肽的同一肽段骨架具有相似碎裂规律的特点，发展出基于“模式识别”的肽段序列鉴定新方法，实现了谱图拓展，显著提高了N-链接位点特异性糖型的鉴定灵敏度，并可发现未知的糖链及糖链修饰（Nat. Commun.）。　　相关研究成果以Global profiling of arginine dimethylation in regulating protein phase separation by a steric effect-based chemical-enrichment method为题，发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。研究工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、大连化物所创新基金等的支持。

大家好，本周为大家分享一篇发表在Analytical Chemistry上的文章，mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation1，文章的通讯作者是威斯康星大学麦迪逊分校的李灵军教授和国家蛋白质科学中心的常乘、贾辰熙教授。　　蛋白质精氨酸甲基化是一种广泛存在于真核生物中且相对保守的翻译后修饰，参与包括RNA加工、DNA修复、染色体组织、蛋白质折叠和基因表达在内的多种生物学过程。蛋白质精氨酸二甲基化在生物过程和人类疾病中发挥着重要作用，但与此同时，精氨酸二甲基化的相对丰度和化学计量通常很低，并且表现出较宽的动态变化范围，这些问题都给分析带来了巨大的挑战。在这篇文章中，作者设计了一种用于二甲基精氨酸代谢标记的mNeuCode标签，并开发了一个名为NeuCodeFinder的软件工具，用于在MS全扫描中筛选NeuCode信号，从而能够在蛋白质组范围内对蛋白质二甲基化进行靶向LC-MS/MS分析。作者将该方法应用到HeLa细胞精氨酸二甲基化的全蛋白质组分析中，证实了该方法的有效性：在70种蛋白质上鉴定到176个精氨酸二甲基化位点，其中38%是新位点。　　图1 用于细胞培养代谢标记的mNeuCode的化学设计。含有由稳定同位素标记的甲硫氨酸和精氨酸的不同组合的mNeuCode-I(红色)和mNeuCode-II(蓝色)分别用于两组细胞培养。同位素标记的甲硫氨酸经过代谢转化为甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet ),随后由蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)催化转移到精氨酸侧链的甲基上。细胞裂解后，将两种样品混合并制备用于高分辨率LC-MS分析。含有二甲基精氨酸的肽的NeuCode同源物被解析后，将显示出43 mDa的质量差异并作为诊断峰。　　图2 基于mNeuCode的精氨酸二甲基化靶向蛋白质组分析。(A)NeuCodeFinder从高分辨率质谱数据中筛选NeuCode同位素峰对的工作流程。从原始数据文件中提取全扫描质谱。单峰被配对以形成NeuCode等值线簇。最终的NeuCode对列表与提取的离子色谱(XIC)值一起导出。(B)靶向LC-MS/MS分析的工作流程，包括样品制备、富集以及MS1和MS2分析。　　在mNeuCode-I标记组中，使用含有正常L-精氨酸和同位素标记L-蛋氨酸[D3]的培养基 在mNeuCode-Ⅱ标记组中，则使用同位素标记的L-精氨酸[15N4]和L-甲硫氨酸[13C]进行培养(图1)。收集两组全细胞蛋白提取物并等量混合，蛋白经还原烷基化与酶切后，得到的肽段通过StageTip分级分离和HILIC tip富集，以提高样品肽段的识别率。处理的样品先进行LC-MS全扫描，通过作者的自制软件NeuCodeFinder生成包含列表，此包含列表用于辅助进一步的平行反应监测(PRM)模式分析(图2)。　　　　图3 已鉴定的精氨酸甲基化位点的生物信息学分析。(A)鉴定的精氨酸二甲基化位点和(B)精氨酸二甲基化蛋白质。橙色柱表示未报道的精氨酸二甲基化位点或蛋白质。绿色柱表示只有单甲基化是已知的，但是二甲基化还没有报道。(C)韦恩图显示，通过使用胰蛋白酶和镜像胰蛋白酶作为消化试剂，从两组实验中鉴定的精氨酸二甲基化位点。(D)蛋白质上位点数目的分布。每个蛋白质上精氨酸二甲基化位点的数量显示在饼图周围，蛋白质的数量列在饼图中。鉴定的精氨酸-二甲基化蛋白质的(E) GO富集和(F)KEGG途径分析。(G)使用STRING数据库将二甲基化蛋白质映射到蛋白质相互作用网络上。综合得分 0.4。(H)已鉴定的精氨酸二甲基化位点中-6和+6氨基酸残基的序列标志。　　通过对数据结果的分析，最终共鉴定到70种蛋白质上的176个精氨酸二甲基化位点，其中37-38%的精氨酸二甲基化位点是新的修饰位点，29%的精氨酸二甲基化蛋白没有被报道过，这证明了mNeuCode方法的有效性。与常规的鸟枪法蛋白质组学策略所获得的数据相比，mNeuCode方法在鉴定低丰度精氨酸二甲基化肽方面具有独特的优势，并且能够补充许多传统鸟枪法蛋白质组学所无法鉴定到的精氨酸二甲基化位点。对mNeuCode方法鉴定到的精氨酸二甲基化蛋白进行生物信息学分析后，发现这些蛋白质主要与RNA的加工、剪接和稳定性相关，参与了RNA的代谢过程。　　图4 FAM98A上精氨酸二甲基化位点的突变抑制了细胞迁移。(A)通过蛋白质印迹检测FAM98A在HeLa细胞中敲除和重建的效果。用siFAM98A-1和siFAM98-2沉默HeLa细胞，然后用Flag标记的WT或突变的FAM98A质粒重建。Anti-FAM98A显示内源性FAM98A的干扰。Anti-Flag显示外源FAM98A的重建。(B)图像和(C)柱状图显示了HeLa细胞的细胞迁移。　　FAM98A是一种微管相关蛋白，与结直肠癌和非小细胞肺癌的增殖有关。有研究者发现FAM98A是PRMT1的底物，但未能确定确切的甲基化位点。而在作者的研究结果中，成功鉴定到FAM98A上五个新的精氨酸二甲基化位点。为了验证这些二甲基化位点是否参与细胞迁移的调节，作者使用FAM98A敲除和FAM98A WT或突变重建细胞系进行了伤口愈合试验。将HeLa细胞的FAM98A基因敲除后，分别用WT或突变的flag-FAM98A重建FAM98A沉默细胞，其中突变的flag-FAM98A将二甲基化位点R351、R360、R363、R371和R375突变为赖氨酸以抑制甲基化。实验结果显示，当FAM98A基因被敲除时，细胞的迁移能力受到抑制，WT FAM98A的重建挽救了FAM98A敲除导致的细胞迁移缺陷，但是突变型FAM98A的重建却不能挽救。该结果证实了FAM98A上的二甲基化位点在细胞迁移中起到的作用。　　总之，在这篇文章中作者发明了一种mNeuCode方法，并开发了NeuCodeFinder软件，使得能够以全蛋白质组的方式进行精氨酸二甲基化的靶向MS/MS分析。实验结果证明了mNeuCode技术对于精氨酸二甲基化的靶向蛋白质组分析的能力和有效性，并证实HeLa细胞FAM98A上新的精氨酸二甲基化位点在细胞迁移调节中的功能，有助于更好地理解癌症发展的潜在机制，为蛋白质组分析的方法学提供了新的思路。　　撰稿：梁梓欣　　编辑：李惠琳　　文章引用：mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation　　李惠琳课题组网址www.x-mol.com/groups/li_huilin　　参考文献　　Wang, Q., Yan, X., Fu, B., Xu, Y., Li, L., Chang, C., & Jia, C. (2023). mNeuCode Empowers Targeted Proteome Analysis of Arginine Dimethylation. Analytical chemistry

DNA甲基化(DNA methylation)是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5' 碳位共价键结合一个甲基基团。为DNA化学修饰的一种形式，能够在不改变DNA序列的前提下，改变遗传表现。DNA甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而控制基因表达。Nature上一项新的研究揭示了一种跨染色质调节途径，即NSD1（一种组蛋白甲基转移酶）介导的H3K36me2是在基因间区域招募DNMT3A和维持DNA甲基化所必需的，并将异常的基因间CpG甲基化与人类肿瘤生长和过度发育相关联在一起。作者发现了一个有趣的现象：塔顿布朗拉赫曼综合征(Tatton–Brown–Rahman syndrome, TBRS)是一种儿童过度生长障碍，是由生殖系统DNMT3A（DNA甲基转移酶3A）突变导致的。儿童期巨脑畸形综合征(Sotos syndrome)是由NSD1（组蛋白甲基转移酶）的单倍剂量不足引起的。这两种疾病具有相同的临床特征，这就非常有意思了：这预示着组蛋白修饰和DNA甲基化修饰可能存在机制上的关联性。首先，研究人员通过全基因组分析和ChIP-seq分析方法发现，组蛋白甲基化修饰H3K36me2和H3K36me3的富集区域非常类似，且明显区别于其他组蛋白甲基化修饰如H3K9me3和H3K27me3所划分的区域。而且H3K36me2和H3K36me3水平与CpG甲基化呈正相关，这与之前报道的H3K36me3介导靶向DNMT3B的活性一致。然而，由于这种相互作用仅限于基因小体，染色质水平上的调控机制并不清楚。在进一步的检测和比较全基因组分析，发现H3K36me3在基因体中表现出特征性的富集，而H3K36me2则表现出更为弥散的分布，包括基因区和基因间区。与H3K36me3相比，DNMT3A选择性富集在H3K36me2高水平区域。接下来，就是我们的独家法宝Alpha技术大显身手的时候了。研究人员采用体外高灵敏度、匀相免疫AlphaLISA技术来阐明H3K36me2介导的DNMT3A募集特异性背后的机制。首先GST标记DNMT3A，纯化后将GST-DNMT3A与生物素化的核小体（不同甲基化的H3K36）置于384孔板。依次加入谷胱甘肽受体微珠，链霉亲和素供体微珠。避光反应60min后置于Envision多模式读板仪中对信号进行检测。通过亲和曲线分析可得知，DNMT3A与H3K36me2修饰的核小体的亲和力最高，其次是H3K36me3，但不与其他价态结合。这些结果表明DNMT3A可以识别H3K36两种甲基化状态，但对H3K36me2的亲和力更强。同时，作者也在体外NSD1突变细胞和临床Sotos综合症病人的血样本中验证组蛋白H3K36甲基化与DNA甲基化修饰的相关性，揭示DNMT3A优先选择H3K36二甲基化区域，促进基因间区的DNA甲基化。这一机制在疾病发生过程中有潜在的生物学意义。珀金埃尔默公司一如既往的为用户提供客制化Alpha Assay检测试剂和高品质的检测设备：EnVision多标记微孔板读板仪EnSight多标记微孔板读板仪Victor Nivo多标记微孔板读板仪参考文献Weinberg D N, Papillon-Cavanagh S, Chen H, et al. The histone mark H3K36me2 recruits DNMT3A and shapes the intergenic DNA methylation landscape[J]. Nature, 2019, 573(7773): 281-286.Dor Y, Cedar H. Principles of DNA methylation and their implications for biology and medicine[J]. Lancet. 2018