自动稀释接种仪

螺旋接种方法自1973年开发以来，现已被广泛应用于食品微生物学、医学细菌学、食品保存和化妆品等领域，是AFNOR V08-100 和 ISO 7218 标准规定的常规方法。 Interscience公司一直致力于螺旋接种仪的技术改进和产品开发。终于在2012年推出第四代螺旋接种仪，即世界上首台带梯度稀释的螺旋接种仪easySpiral Dilute，实现了自动稀释与接种功能二合一。对于有计数需求的客户，既可利用螺旋接种方法实现快速计数，又可利用传统梯度稀释法计数，自动化的操作可大大提高工作效率。 此接种仪可实现5 x 1/10th 连续梯度稀释，并自动涂布菌液。一个培养皿即可实现计数的原始菌液浓度范围可达30 ~107 CFU/mL。 将菌液置于样品杯中easySpiral Dilute自动将菌液进行连续梯度稀释。easySpiral Dilute自动接种稀释后的菌液。 均一模式 指数模式 圆圈模式 模拟手工均一接种 浓度递减模式 一个培养皿三个稀释度接种 50 &mu L, 100 &mu L, 200 &mu L 50 &mu L, 100 &mu L, 200 &mu L 0 &mu L内圈, 27 &mu L 中圈, 或USB 编程 或USB 编程 56ul外圈 接种后 培养后 原始菌液与稀释后的菌液可选择均一模式，模拟手工梯度稀释接种方式，亦可选择指数模式进行浓度递减接种。接种后的培养皿经过培养，图片如上图，可选择手工计数或自动菌落计数仪进行计数。 整个稀释与接种过程自动进行，消除了人为操作产生的误差，可节省高达50%的人力、物力与时间成本，且专利式的清洗设计，保证不会产生交叉污染，是食品、药品与化妆品微生物实验室的理想选择。

2013年五洲东方公司系列有奖问答二&mdash &mdash &ldquo Interscience梯度稀释螺旋接种仪有奖问答&rdquo 活动开始啦!全部回答正确者即可获得由五洲东方公司提供的精美奖品一份。熟悉实验方法的网友不要犹豫了，快来参加吧!活动开始时间：2013年3月。活动奖励：全部答全答对的网友将获得精美礼品一份。答题规则如下：我们会提供参考文章，您可以阅读完文章后答题。本次试题共5题，1-5题都必须答全。点击下载试题Interscience梯度稀释螺旋接种仪有奖问答问题.doc，填写完整后，您可以：1)将问卷邮件至g.y_liu@ostc.com.cn。2)将问卷邮寄至北京五洲东方公司(&ldquo 北京市海淀区北四环中路265号中汽大厦7层&rdquo ，邮编：100083，刘广宇收)。奖品发放：收到问卷经审核后，将发放精美奖品。为了保证奖品能顺利发送到您的手中，请将您的所有联系方式全部填写全面。活动咨询电话：400-011-3699活动详情：&ldquo Interscience梯度稀释螺旋接种仪有奖问答&rdquo &mdash &mdash 2013年五洲东方公司系列有奖问答二请关注下期有奖问答活动：2013年五洲东方公司系列有奖问答三所有活动信息请关注五洲东方官方网站www.ostc.com.cn首页公告栏。感谢您的参与!

介绍细胞系生成通常被认为是一个漫长而乏味的过程，需要大量的劳动力和材料投资。在细胞系开发中，尤其是在单克隆抗体和蛋白质治疗剂的生产中，需要具有高活性的单克隆性和稳健的克隆生长。自动细胞分配和细胞计数技术可提高通量，同时减少分配、识别和验证每孔单个细胞是否存在所需的时间和劳动力。本研究比较了使用自动Formulatrix Tempest液体分配器和Brooks Celigo成像细胞仪与电动手动移液和手动分析将CHO细胞分配和分析到384孔板的情况。 方法和材料I. 细胞培养为了制备单细胞接种和克隆生长的细胞， CHO-K1YFP细胞在T-25c㎡的烧瓶中用含有10% FBS和1%G418的F-12K培养基进行贴壁培养。细胞在37℃和98%的相对湿度下，置于5%的二氧化碳中培养。为了进行活性研究，将悬浮的CHO（CHOs）细胞培养在125mL的锥形瓶（Corning #430421）中，其中含有30mL CD CHO培养基（Gibco #10743），还添加了20mM GlutaMax（Gibco #35050-061）和1%HT（Gibco #11067）。细胞在37°C和98%相对湿度的8%CO2中置于轨道振动台（130 rpm）上培养。II. 使用Tempest或手动移液器进行单细胞接种用胰蛋白酶-EDTA (0.25%/0.5 mM) 收集表达黄色荧光蛋白 (YFP) 的 CHO-K1 细胞并重新悬浮在培养基中。细胞通过 40 µm 细胞过滤网 (BD Falcon #352340) 传代两次以获得没有聚集体的细胞悬浮液，然后使用血细胞计数器计数并稀释至200个细胞/mL。使用来自Formulatrix的 Tempest或手持式Matrix电子多通道移液器（Thermo Fisher #2231，12通道384均衡器移液器，2-125 µl）接种培养基和细胞。Formulatrix Tempest是一种非接触式的散装试剂分配器，可通过96个单独控制的喷嘴同时分配多达12种独立成分的任何体积。Tempest正在申请专利的微流控阀组利用正排量技术分配离散的液体体积，能够准确无误地分配到96孔、384孔和1536孔板。此外，使用标准移液器吸头作为源储液器可将死体积减少到100微升，是珍贵样品分配的最佳选择。在细胞接种之前，将25µL/孔的培养基分装到384孔板（Corning #3542）。随后以5微升/孔的细胞悬液（每种分配方法n=3）接种。将板离心以收集每个孔底部的细胞，然后孵化直到成像。III. 使用Brooks Celígo S进行单细胞接种成像使用Celígo成像细胞仪对孔板进行处理，以检测每孔单细胞和克隆生长。Brooks Celígo成像细胞仪是一种高速、易用、多通道亮场和荧光成像细胞仪，用于高通量、全孔细胞图像采集和多孔板处理。Celígo提供明 场成像和三通道荧光成像功能，用于可视化和量化烧瓶和6孔至1536孔微孔板中的细胞反应。该系统提供1µm/像素的全分辨率。整个Celígo是为明场和荧光成像而开发的，它结合了专有的光学器件和软件，可以在整个孔板一直到孔板边缘以一致的对比度对细胞进行成像和识别，这样能够识别细胞的位置和面积，而不需要额外的潜在细胞毒性荧光探针。在第0天使用双通道采集应用程序对孔板进行成像，使用荧光图像进行细胞检测，并使用明场图像对单细胞存在进行视觉验证。经过四天的培养期后，在双通道采集应用中再次对平板成像。明场成像用于确认克隆生长。IV. 活性和接种效率取决于Celígo在培养箱中过夜恢复后，比较了两种分配方法之间的活性测量。对于过夜恢复后的活性测定，将CHO细胞制备成细胞悬液，并使用Tempest 或电动移液器以每孔 500 个细胞的浓度移液到 384 孔板（Corning 3542）中。将板温育过夜。将浓度为 5µg/mL (8uM) 的 Hoechst 33342（Life Technologies，#H3570）和 2µg/mL(3uM)的碘化丙啶(PI)（Life Technologies，#P3566）加入孔中并孵育 30 分钟。使用Celígo对板进行成像和分析其活性。数据和结果I. 单细胞接种为了比较手持式电动移液器和Formulatrix Tempest之间细胞的正确分 配，对检测到单个细胞的孔数进行了量化。用电动移液器手动接种36%（3%CV）的单细胞孔板，Tempest接种32%（2%CV）的单细胞孔板（图1）。两种接种方法在单细胞接种中表现相同，无统计学差异（P0.01，n=3）。II. 克隆生长通过在第0天和第4天对单个细胞生长为一个菌落的孔进行视觉跟踪，可以很容易地用Celígo监测克隆生长的比较。图2显示了单个细胞生长成菌落的代表性图像。细胞和菌落都可以在Celígo的明场和荧光通道中看到。这允许对手持电动移液器和Formulatrix Tempest之间的克隆生长进行量化评估，其中91%（6%CV）和91%（4%CV）的单个细胞分别生长成一个菌落（图3）。这些结果表明，两种分配细胞的方法在克隆生长方面没有统计学差异（P0.01，n=3）。III. Celígo检测活性和接种效率对于两种接种方法，使用CHO-S细胞监测细胞活性。在一夜恢复期内，Tempest接种法的存活率测量值为97.4%（1.1%CV），电动移液器接种法的存活率测量值为98.9%（0.7%CV）（表1）。两种方法在接种后恢复得同样好。与平板上的细胞计数相比，Formulatrix Tempest的重复性更好，CV为10%，而电动手动移液器的CV为17%（表1）。IV. 手动与自动液体分配和孔板分析的对比与手动分配和孔板分析相比，自动化分配和孔板分析过程可大幅提高吞吐量。将细胞手动分配到384孔板大约需要3分钟，并且会受到更大的可变性和人为错误的影响。Tempest可以在大约40秒内将细胞有效地分配到384孔板上，节省了时间并提高了准确性。手动分析孔板以验证单个细胞的存在，这一劳动密集型过程每孔大约需要30秒，或384孔板需要192分钟，而Celigo S在大约7分钟内完成图像采集和分析过程。自动分配和分析384孔板大约需要8分钟，而手动分配和分析大约需要195分钟。因此，自动化过程将分配细胞和分析孔中是否存在单个细胞的产量提高了约25倍（图4）。总结本研究的目的是评估自动液体分配系统与基于孔板的细胞仪在单克隆细胞系开发中的使用。 要开发单克隆细胞系，必须首先分配实验孔板，然后验证每孔是否存在单个细胞。这些步骤可能既费时又费力，并且会大大增加实验费用。将 Formulatrix Tempest 液体分配器与 Brooks CeligoS 成像细胞仪相结合，创建了一个快速、高效和可靠的系统，用于分配和识别具有单细胞的孔。Formulatrix Tempest 在每块板不到 40 秒的时间内自动将细胞分配到 384 孔板，这比电动移液器分配快两分钟多。此外，使用Tempest消除了手动分配所需的材料槽和移液器吸头等材料的额外消耗成本。通过 Celígo S 自动评分对每孔细胞或菌落数量进行量化。结果分析表明，Formulatrix Tempest 将单个细胞分配到32% 的孔中，同时保持细胞活性。 与手动移液器分配和每孔单细胞分析相比，将两台机器一起使用可节省 95%以上的时间。