降酮短杆菌

使用超高效合相色谱(UPC2)分析短杆菌肽 Sean M. McCarthy, Andrew J. Aubin, 和 Michael D. Jones 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 应用效益 ■ 快速分离短杆菌肽 ■ 载量线性响应 ■ 准确、高精度分析短杆菌肽的方法 ■ 有可能用于其它疏水性肽和蛋白质 沃特世解决方案 ACQUITY UPC2系统 ACQUITY® SQD ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱 Empower&trade 3软件 关键词 超高效合相色谱、UPC2、疏水性肽、短杆菌肽 简介 用反相液相色谱(RPLC)分析疏水性肽和蛋白质难度很大，因为溶液中经常需要使用洗涤剂保持疏水性物质的稳定性，而这些洗涤剂容易发生聚集和/或沉淀，严重影响它们的回收，这些因素以及其它原因使得难以用RPLC分离疏水性肽和蛋白质。 在本应用纪要中，我们为您介绍一种在ACQUITY UPC2TM系统上使用沃特世(Waters® )超高效合相色谱技术分离典型跨膜肽-短杆菌肽的方法。 短杆菌肽是由芽孢杆菌产生的一种常见和已被良好表征的跨膜肽物质，它被用作对抗革兰氏阳性和某些革兰氏阴性细菌的局部用抗生素，短杆菌肽包括通用组成为甲酰-L-缬氨酸-甘氨酸-L-丙氨酸-D-亮氨酸-L-丙氨酸-D-缬氨酸-L-缬氨酸-D-缬氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-X-D-亮氨酸-L-色氨酸-D-亮氨酸-L-色氨酸-氨基乙醇的一族化合物，其中X取决于短杆菌肽分子，即分别占总短杆菌肽量约87.5%、7.1%和5.1%的革兰氏A(X=色氨酸)、革兰氏B(X=苯丙氨酸)和革兰氏C(X=酪氨酸)，1需要交替的D和L氨基酸单元构成_-螺旋状。 我们研究了色谱柱化学品、流动相改性剂和梯度斜率对分离短杆菌肽的影响。采用优化方法分离市场上销售的非处方药物(OTC)，将测定的短杆菌肽浓度与标示量进行对比。采用质谱仪测定短杆菌肽的浓度，采用选择离子谱表征每种物质。在ACQUITY UPC2系统上使用我们的方法，可得到线性和可重复的结果&mdash &mdash 测定的OTC制剂浓度为标示量的98.4%。 试验 测试条件 除非另有说明，以下是用于所有色谱最终方法的最佳条件。 UPC2测试条件 UPC2系统: ACQUITY UPC2 检测器： PDA、ACQUITY SQD PDA @ 280nm,分辨率为6 nm(补偿400至500 nm) 色谱柱： ACQUITY UPC2 CSH 氟苯基,3.0 x 100 mm, 1.7 &mu m 柱温： 50 ° C 样品温度： 15 ° C UPC2 ABPR: 1885 psi 进样量： 1 &mu L 流速： 2.0 mL/min 流动相A： CO2 流动相B： 含0.1%TFA的甲醇(除非另有标示) 梯度： 20%至30% B，1.5min SQD条件 离子源： ES+ 锥孔电压： 20 V 毛细管电压：3.7kV 源温度： 150 ° C 脱溶剂气温度： 500 ° C 脱溶剂气体流速： 400 L/hr 锥孔气体流速： 25 L/hr SIR: 922.6,930.3,941.9 数据管理 Empower 3软件 样品描述 用解硫胺素芽孢杆菌(短芽孢杆菌)制备的短杆菌肽从Sigma Aldrich公司购买，将样品溶解在甲醇中制成0.5mg/mL浓度的溶液，如需要，可用甲醇稀释。含有短杆菌肽的非处方软膏是从当地药店购买的。将0.2g软膏溶解在10mL正己烷中，然后用5mL甲醇萃取短杆菌肽，去除甲醇层，用0.2-&mu m的烧结玻璃盘过滤，然后直接进样ACQUITY UPC2系统。 结果与讨论 我们系统性地筛选了四种色谱柱，测定哪种分离效果最佳，结果如图1所示，色谱柱筛选过程可在1小时内非常快速地完成。在我们设定的筛选条件下，BEH 2-EP和BEH色谱柱未检测到谱峰，由于其它色谱柱表现出合适的色谱性能，因而未对这两者的非洗脱原因深入研究，其中ACQUITY UPC2 CSH氟苯基色谱柱检测的色谱峰形最佳，因此采用该色谱柱继续研究。 图1.通过短杆菌肽标准物的色谱峰形和保留时间筛选各种化学特性色谱柱。所有色谱柱规格为3.0x100mm，填装亚-2-微米填料；所有分离条件都采用流动相 A：CO2、流动相 B、含0.1% FA的MeOH、2 mL/min, 3%B至25% B，5min。 为了分离短杆菌肽物质，对酸性改性剂的影响进行了研究，结果表明：使用三氟乙酸(TFA)可得到稍好的峰形，提高了短杆菌肽A和短杆菌肽C之间的分离度，结果如图2所示。已知TFA会抑制质谱电离，但每种物质的信号都足以定量检测治疗制剂，后续将对此进行讨论。对于要求更高灵敏度的应用，可能需要降低TFA浓度或使用甲酸，以达到希望的检测限值。 图2.酸性改性剂对分离短杆菌肽的影响。 当设置好合适色谱条件后，通过减少梯度时间优化分离过程，结果如图3所示，我们能够在1.5分钟时间内使每种短杆菌肽组分的分离度达到1.4或更高，在相同流速下通过减少运行时间增加梯度斜率，不但实现有效分离，同时还将短杆菌肽A的信噪比从336提高至605。 图3.UV 280-nm痕量检测优化分离短杆菌肽A、B和C。 我们测试了最佳分离条件，能够使用单四极杆质谱(SQD)检测每种物质，图4显示：每种物质都被质谱良好分离和检测到，另外每种短杆菌肽物质都显示含有绝大多数的M+2H离子，后续的研究将使用这些参数进行选择离子监测。 图4：每种短杆菌肽物质的总离子图谱-A和加合离子图谱-B-D。选择强度最高的离子评估市场上销售的抗菌制剂中的短杆菌肽含量，对于多肽序列，红色残基是L型同分异构体，黑色残基是D型同分异构体。 为了评估我们的方法是否适用于定量分析市场上销售的非处方药中的短杆菌肽，我们在ACQUITY SQD上使用选择离子监测，结果如图5A所示。我们绘制浓度-峰面积曲线，得到每种物质的校正曲线。结果发现：如图5B-D所示，每种成分在测试范围内都呈线性响应。另外还使用校正曲线测定了非处方药物中的每种短杆菌肽物质浓度。 图5，图A-25.0、12.5、1.25和0.625mg/mL浓度的标准溶液中含有短杆菌肽物质的叠加选择离子谱。图B、C和D-每种短杆菌肽A、B和C各自的MS峰面积线性拟合图。 使用开发的方法评估非处方药物中的短杆菌肽物质的浓度和相对丰度。如图6所示，重复分析结果表明：每种短杆菌肽%RSD值小，计算浓度与标签上的标称值相吻合；我们还发现短杆菌肽物质的相对丰度与文献报道的丰度非常吻合1。 图6. 从抗菌软膏中萃取的短杆菌肽A、B和C的叠加选择离子谱重复进样分析的计算RSD值(N=3)在可接受限值以内，计算丰度与文献报道数值非常吻合1。 结论 正如本应用纪要所展示的，ACQUITY UPC2系统与ACQUITYUPC2色谱柱化学结合使用，可为短杆菌肽提供简单、准确和可重现的分析方法。该工作表明ACQUITY UPC2系统可用于分析疏水性肽，还可能用于分析疏水性蛋白质，例如膜蛋白。 参考文献 1. The Merck Index and Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals.13th ed. Whitehouse Station, NJ : Merck Research Laboratories 2001. 关于沃特世公司 (www.waters.com) 50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。 作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。 2010年沃特世拥有16.4亿美元的收入和5,400名员工，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。 联系人： 叶晓晨 沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部 xiao_chen_ye@waters.com 周瑞琳(GraceChow) 泰信策略(PMC) 020-83569288 13602845427 grace.chow@pmc.com.cn

恒天然"肉毒杆菌门"大事记 　　8月2日，新西兰乳制品巨头恒天然集团2日向新西兰政府通报称，其生产的3个批次浓缩乳清蛋白(WPC80)中检出肉毒杆菌，影响包括3个中国企业在内的8家客户。 　　8月2日晚间，中国国家质检总局官网发布消息，要求进口商立即召回可能受污染产品。 　　8月3日，新西兰初级产业部发表声明，已经确定5个批次"可瑞康"牌2段婴儿配方奶粉使用含有肉毒杆菌的浓缩乳清蛋白粉，建议新西兰父母暂停为6个月以上宝宝喂食"可瑞康"牌2段婴儿配方奶粉。 　　8月3日，恒天然举行新闻发布会，执行董事加里· 罗马诺介绍说，检测显示，新西兰本地一家工厂2012年5月生产的3批浓缩乳清蛋白含有肉毒杆菌。这些"受污"产品总量达40吨左右。暂时没有收到"受污"产品引发的健康问题报告。此外，这些可能造成服食者中毒的受污染浓缩乳清蛋白粉被提供给8家制造商，用作生产婴儿奶粉、儿童成长奶粉和运动饮料的原料，涉事产品估计达到900吨。 　　8月4日，中国国家质检总局公布3个品牌的4家"涉事"中国公司。 　　新西兰乳制品巨头恒天然集团宣布旗下一个公司生产的乳清蛋白粉检出肉毒杆菌后，新西兰政府启动大范围产品召回，涉及中国等7个国家，产品总量可能达到1000吨。 　　国家质检总局今天上午通报，有4家中国企业进口了可能受到肉毒杆菌污染的新西兰恒天然集团产品。其中包括娃哈哈、多美滋等品牌。 　　目前，多美滋已在官网发布召回公告，并公布了涉事产品的具体名称和批号。 　　通报 　　质检总局： 　　四家公司进口问题原料 　　今天上午，记者从国家质检总局获悉，经中新双方核查，现初步确定，有4家中国境内进口商进口了可能受到肉毒杆菌污染的新西兰恒天然集团产品。其中涉及娃哈哈、多美滋、上海糖业烟酒集团等企业。据悉，涉事进口企业已对涉及的问题产品采取追溯、召回等措施。 　　企业 进口情况 杭州娃哈哈保健食品有限公司和杭州娃哈哈进出口有限公司 进口浓缩乳清蛋白14.475吨 　　上海市糖业烟酒(集团)有限公司 进口浓缩乳清蛋白4.800吨 多美滋婴幼儿食品有限公司 进口原料乳粉208.550吨 　　食药监总局：涉事企业还有可口可乐 　　记者上午从国家食品药品监督管理总局获悉，8月3日，国家食药监总局发出紧急通知，要求上海市、浙江省食品药品监督管理局会同质量技术监督局，立即开展对新西兰浓缩乳清蛋白粉肉毒杆菌问题的调查，进行系列检验检测，做好风险防范工作。 　　今天上午，国家食品药品监督管理总局约谈上述3家企业的相关负责人，要求尽快查明情况、分析原因，迅速采取措施，立即停止销售并召回问题原料加工的全部食品。 　　食药监总局相关负责人表示，国家食药监总局高度重视，密切关注事件发展，有关情况将及时向社会公布。据悉，约谈的企业还有可口可乐公司，因为上海糖业烟酒把原料卖给了可口可乐。 　　追访1 　　娃哈哈：爱迪生奶粉乳源来自荷兰 　　今天上午，娃哈哈爱迪生奶粉北京旗舰店客服人员向记者表示：该品牌奶粉"乳源是荷兰的，不是新西兰，因此未受到此次污染事件影响"。 　　记者随后致电杭州娃哈哈集团，该集团相关负责人表示，相关资料正在整理中，稍后给记者回复。不过，截至发稿时，记者仍未收到其回复。 　　娃哈哈 　　杭州娃哈哈保健食品有限公司和杭州娃哈哈进出口有限公司 　　1、婴幼儿奶粉：爱迪生奶粉(乳源来自荷兰，并非新西兰，未受影响) 　　2、饮料 　　1)含乳饮料呦呦奶茶、营养快线、爽歪歪、智慧超人儿童酸牛奶 　　2)功能饮料：激活、启力 　　3)其他：包装水、果汁饮料、凉茶等 　　追访2 　　多美滋：召回多领加和优阶贝护产品 　　多美滋今天上午发布声明表示，根据恒天然今天提供的信息，多美滋已查明部分优阶贝护和多领加二阶段产品有可能受到影响，共涉及12个批次。其中部分已经被迅速封存，未流入市场。多美滋其他产品未受影响，消费者可放心使用。 　　多美滋方面表示："多美滋已启动召回程序，将对以上产品实施预防性召回，并全部销毁。如您已购买相关产品，建议立刻停止使用。"同时，多美滋公布了咨询热线400-880-5288，消费者可拨打咨询。 　　召回产品的具体名称和批号 　　产品品名 净重 批号多领加延续较大婴幼儿 1200g 1F3144配方奶粉(2阶段) 　　400g 1F3171优阶贝护延续较大婴儿 360g× 3 2E3170、1E3182配方奶粉(2阶段) 　　400g 1C3170、2C3180400g× 3 2E3172、1E3181850g+50g 1H3172、1H3180900g 2H3166、2H3181 　　乐友下架多美滋涉事产品 　　今天上午记者从京城多家零售终端了解到，各商场、超市和电商平台"高度重视这次奶粉污染事件"，并已经展开自查，如果发现库存中有涉事批次的产品，会按照不合格产品下架流程处理。不过，记者也注意到，目前部分超市多美滋的产品还在正常销售，一些超市的负责人表示，还不清楚情况，并没有接到多美滋方面的通知。 　　"为了保险起见，我们临时下架了电商和实体店中所有多美滋二段的产品，不仅是涉事批次的。"乐友相关负责人表示。乐友在了解到奶粉涉嫌污染事件的消息后，在没有得到厂家正式通知前，第一时间由该公司商品质检部门宣布全国360余家门店以及网站，对多美滋二段奶粉实施商品下架。乐友同时表示，今天会将下架工作进行完。 　　据悉，多美滋婴幼儿奶粉在京城多家超市有售，销量一直不错。截至记者发稿时，在1号店、京东商城等电商平台上，多美滋此番涉事的"多领加延续较大婴幼儿配方奶粉"和"优阶贝护延续较大婴幼儿配方奶粉"仍在正常销售。记者注意到，在上述商品的购买评价和顾客咨询中，已经有不少人留言询问"肉毒杆菌污染"事件，不少妈妈对此十分担忧。 　　追访3 　　可口可乐产品或涉肉毒杆菌 　　记者上午尝试联系上海糖业烟酒集团，但是截至发稿时，暂时没有得到该集团针对此事的回应。 　　据公开的资料，品牌代理业是上海糖业烟酒集团的核心主业之一，秉承60年全国市场食品批发分销代理的历史，其打造了以南浦集团、捷强集团为主的多平台品牌代理体系。其代理的品牌包括：恒天然、雀巢、惠氏和蒙牛。 　　根据食药监总局的约谈记者了解到，上海糖酒集团将进口的恒天然问题乳清蛋白销售给了可口可乐中国有限公司。可口可乐公司相关人士表示，目前已经获悉该事件，目前初步确定为果粒奶优，现在公司正统计可能存在隐患的饮料批次。 　　记者了解到，乳清蛋白除了可以使用在奶粉中，还可添加在含乳饮料和功能饮料中。可口可乐除了碳酸饮料外，也在销售含乳饮料和功能饮料，分别为美汁源果粒奶优和维他命水。 　　记者上午在一家超市内看到，市面在售的可口可乐旗下含乳饮料名为&ldquo 美汁源果粒奶优&rdquo ，有芒果味、水润蜜桃味、草莓等多种口味。配料表显示其含有浓缩乳清蛋白。该款产品于2009年推出，在各大超市有售。

为了配合国家质检总局对婴幼儿配方奶粉及液态奶的阪崎氏肠杆菌的专项检查，对降低婴幼儿配方奶粉的风险，保证代乳品的安全性。我公司综合最近客户需求以及FAO/WHO（联合国粮农组织/ 世界卫生组织）公布的阪崎氏肠杆菌标准检测方法特推出阪崎氏肠杆菌专业检测配套用离心机（台式高速离心机 TG16-WS）配合专业实验室机构检测工作。 阪崎氏肠杆菌（Enterobacter sakazakii）是人和动物肠道内寄生的一种革兰氏阴性无芽孢杆菌，阪崎肠杆菌是肠杆菌科的一种，1980年由黄色阴沟肠杆菌更名为阪崎肠杆菌。阪崎肠杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和茵血症，死亡率高达50％ 以上。目前，微生物学家尚不清楚阪崎肠杆菌的污染来源，但许多病例报告表明婴儿配方粉是目前发现的主要感染渠道。阪崎肠杆茵的生物学性状及其对人群的健康危害受到人们的关注并被报告。因此我国在2005年5月通过《奶粉 中阪崎肠杆菌检测方法》行业标准的审定。 中国检科院与天津出入境检验检疫局联合十几家单位，从2003年初即开展了阪崎肠杆菌检测方法研究。课题组目前已建立了阪崎肠杆菌的改进型传统检测方法（经典方法）、普通PCR方法和荧光PCR方法（快速筛选方法），并分别进行了初步验证实验，其中改进型传统方法与美国FDA方法相比检测结果一致，但检测时间缩短三分之一至二分之一. TG16-WS台式高速离心机技术参数: ◆最高转速: 16000r/min ◆最大相对离心力:17800xg ◆定时范围:0～99min ◆电机:直流无刷、微机控制 ◆电源:Ac220V 50Hz 5A ◆整机噪声:≤65dB(A) ◆外形尺寸:390×330×300mm(L×W×H) ◆重量:25kg 推荐标配转子： 转子名称 最高转速 最大相对离心力 容量 备注 角转子 16000r/min 17800×g 12×1.5ml 特价 角转子 12000r/min 14800×g 12×10ml 特价 标准检测方法下载（SN 中国出入境检测检疫行业标准）： SN 1632.2-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第2部分PCR方法.pdf SN 1632.3-2005 奶粉中阪崎肠杆菌检验方法 第3部分荧光PCR方法.pdf