远藤氏琼脂

一、凝胶制备1. 微波炉溶解琼脂糖时，胶液沸腾冲溢出三角锥瓶微波炉加热时胶液可能发生剧烈沸腾，（1）总液体量不宜超过三角锥瓶的50%容量。（2）2%以上胶液设置中火加热。 （3）胶液剧烈沸腾时，停止加热，移开三角锥瓶，请戴上防热手套，小心摇动三角锥瓶，然后再次加热，胶液沸腾直至胶液清澈，保证琼脂糖完全溶解。 2. 琼脂糖电泳图像背景模糊不清：琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清。完全溶解的琼脂糖胶液清澈，三角锥瓶内壁应没有粘附琼脂糖颗粒。 3.加热后水分蒸发，如需要应加入热的蒸馏水，补足到原来的重量，摇匀。 二、电泳1. DNA条带模糊，拖尾。 （1）DNA降解。避免核酸酶污染。 （2）DNA上样量过多。减少凝胶中DNA上样量。 （3）电泳缓冲液陈旧:电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 （4）电泳条件不合适。电泳时电压不应超过20 V/cm，温度＜30℃,巨大DNA链，温度应＜15℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 （5）DNA样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 （6）有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。 （7）DNA变性。电泳前勿加热，用20 mM NaCl缓冲液稀释DNA。[/c

琼脂扩散是抗原抗体在凝胶中所呈现的一种沉淀反应。抗体在含有电解质的琼脂凝胶中相遇时，便出现可见的白色沉淀线。这种沉淀线是一组抗原抗体的特异性复合物。如果凝胶中有多种不同抗原抗体存在时，便依各自扩散速度的差异，在适当部位形成独立的沉淀线，因此广泛地用于抗原成分的分析。琼脂扩散实验可根据抗原抗体反应的方式和特性分为单向免疫扩散、双向免疫扩散、免疫电泳、对流免疫电泳、单向及双向火箭电泳实验。一、单向琼脂扩散实验1. 材料（1）诊断血清（抗体：抗人IgG或IgA免疫血清）（2）待检血清（抗原）：人血清http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/B1361084631_small.jpg （3）参考血清：全国统一人血清免疫球蛋白参考血清（批号不同，免疫球蛋白含量不同）。（4）其它：生理盐水、琼脂粉、微量进样器、打孔器、玻璃板、湿盒等。2. 方法（1）将适当稀释（事先滴定）的诊断血清与予溶化的2%琼脂在60℃水浴预热数分钟后等量混合均匀制成免疫琼脂板。（2）在免疫琼脂板上按一定距离（1.2~1.5 cm）打孔，见图1。（3）向孔内滴加1：2，1：4，1：8，1：16，1：32稀释的参考血清及1：10稀释的待检血清，每孔10 μl，此时加入的抗原液面应与琼脂板一平，不得外溢。（4）已经加样的免疫琼脂板置湿盒中37℃温箱扩散24小时。（5）测定各孔形成的沉淀环直径（mm），用参考血清各稀释度测定值绘出标准曲线，再由标准曲线查出被检血清中免疫球蛋白的含量。二、双向琼脂扩散实验1. 材料（1）诊断血清：兔抗人血清（2）待测血清：人血清（3）阴性对照血清（4）其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。2. 方法（1）取一清洁载玻片，倾注3.5~4.0 ml 加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。（2）凝固后，用直径3 mm 打孔器，孔间距为5 mm。孔的排列方式如图2所示。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084537_small.jpg（3）用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。（4）加样后的琼脂板收入湿盒内置37℃温箱中扩散24~48小时。（5）结果观察：若凝胶中抗原抗体是特异性的，则形成抗原—抗体复合物，在两孔之间出现一清晰致密白色的沉淀线，为阳性反应。若在72小时仍未出现沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性对照。出现阳性对照与被检样品的沉淀线发生融合，才能确定待检样品为真正阳性。（6）结果分析：琼脂扩散结果受许多因素影响。①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图3。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084538_small.jpg②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图4。http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/02/A1361084539_small.jpg③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0~37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25~0.5 cm 为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1~3天出现，14~21天出现的数目最多。玻片法可在1~2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。

版主老师：请教您08版国标中菌落总数改营养琼脂为计数琼脂的优点是什么？两个培养基用的话区别大否？谢谢