绿脓假单胞菌

包装饮用水中铜绿假单胞菌的检测和鉴定[img=,690,513]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111925505308_7597_2166779_3.png!w690x513.jpg[/img][img=,690,443]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111926022842_4589_2166779_3.png!w690x443.jpg[/img][color=#404040]致病性[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]主要致病物质是[/color][color=red]内毒素[/color][color=#404040]，此外尚有菌毛、荚膜、胞外[/color][color=#404040]酶和外毒素等多种致病因子。可引起局部化脓性炎症[/color][color=#404040]，也可引起中耳炎、角膜炎、尿道炎、胃肠炎、心内[/color][color=#404040]膜炎 、脓胸，还可引起菌血症、败血症及引起婴儿严[/color][color=#404040]重的流行性腹泻。[/color][color=#404040][color=#404040] [/color][color=#404040]国内外污染情况[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]参考文献[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]国内污染情况：[/color][color=#404040] -[/color][color=#404040]瓶装天然矿泉水铜绿假单胞菌的检出率[/color][color=#404040]1.2[/color][color=#404040]％～[/color][color=#404040]23.6[/color][color=#404040]％；[/color][color=#404040] -[/color][color=#404040]瓶装饮用纯净水铜绿假单胞菌的检出率[/color][color=#404040]11.6[/color][color=#404040]％。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]国外污染情况：[/color][color=#404040] -Richards[/color][color=#404040]等在[/color][color=#404040]104[/color][color=#404040]件检品中的[/color][color=#404040]4[/color][color=#404040]件分离到铜绿假单胞菌；[/color][color=#404040] -Rosenberg[/color][color=#404040]报告德国[/color][color=#404040]1.2[/color][color=#404040]％～[/color][color=#404040]10.2[/color][color=#404040]％的瓶装矿泉水检出铜[/color][color=#404040] 绿假单胞菌。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]刚出厂的产品中铜绿假单胞菌数量较少，但有文献报[/color][color=#404040] 道[/color][color=#404040]5[/color][color=#404040]加仑桶装产品（[/color][color=#404040]15[/color][color=#404040]～[/color][color=#404040]31[/color][color=#404040]天的保存期），铜绿假单胞[/color][color=#404040] 菌可生长繁殖达到 [/color][color=#404040]10^4 CFU/ml[/color][color=#404040]。[/color][/color][color=#404040][color=#404040]• [/color][color=#404040]国内卫生标准：[/color][color=#404040]0 CFU/250ml[/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#262626]二、实验室检验[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040] [/color][color=red]GB 8538-2016 [/color][color=#404040]铜绿假单胞菌检测（滤膜法）[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040]原 理 将250mL水样用孔径为0.45μm的滤膜过滤，并将滤膜移至CN琼脂培养基上，于36℃士1℃恒温箱中培养48h，能够在CN琼脂上生长并产生绿脓菌素，或者能够在CN琼脂上生长并且氧化酶呈阳性、紫外光（360±20nm）照射下能发荧光、能够利用乙酰胺产氨的革兰氏阴性无芽孢杆菌，经证实为铜绿假单胞菌，则其检测结果为阳性。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040][img=,690,513]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111930447074_3628_2166779_3.png!w690x513.jpg[/img][img=,690,496]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111930529842_4361_2166779_3.png!w690x496.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040]操作步骤-水样过滤 在100级的洁净工作台进行过滤操作。首先用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将250mL水样或稀释液通过孔径0.45μm的滤膜过滤，然后将过滤后的滤膜贴在已制备好的CN琼脂平板上，平铺并避免在滤膜和培养基之间夹留着气泡。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040][img=,690,518]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111939198094_2367_2166779_3.jpg!w690x518.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#262626][color=#404040][img=,690,504]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111941176488_2216_2166779_3.png!w690x504.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040]可疑菌落计数情况[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]计数所有显[/color][color=red]蓝色或绿色（绿脓色素）[/color][color=#404040]的菌落，初步判定为铜绿假单胞菌。（需要做绿脓菌素的测定）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]计数滤膜上所有[/color][color=red]发荧光不产绿脓色素[/color][color=#404040]疑似铜绿假单胞菌菌落，并进行乙酰胺肉汤确定试验。[/color][color=#404040]（在紫外线下检查滤膜时，应避免长时间在紫外光下照射，否则可能会将平板上的菌落杀灭，而导致无法在证实培养基上生长。）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]将其它所有[/color][color=red]红褐色不发荧光[/color][color=#404040]的菌落进行氧化酶试验、乙酰胺肉汤、金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基确证实验。[/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040][img=,690,520]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111942538578_905_2166779_3.png!w690x520.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040][img=,690,518]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111945093378_4789_2166779_3.png!w690x518.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#404040]纯 化• 营养琼脂：将需验证的可疑菌落划线接种营养琼脂培养基，于36℃±1℃培养 20h～24h，对可疑菌进行纯化[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040] 将最初显红褐色的菌落进行[/color][color=red]氧化酶试验[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]氧化酶试验 ：[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]原理：氧化酶（细胞色素氧化酶）是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。具有氧化酶的细菌，首先使细胞色素[/color][color=#404040]C[/color][color=#404040]氧化，再由氧化型细胞色素[/color][color=#404040]C[/color][color=#404040]使对苯二胺氧化，生成有色的醌类化合物。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]操作：取[/color][color=#404040]2[/color][color=#404040]～[/color][color=#404040]3[/color][color=#404040]滴新鲜配制的氧化酶试剂滴到放于平皿里的洁净滤纸上。用铂金丝接种环或玻璃棒，将适量的纯种培养物涂布在预备好的滤纸上。在[/color][color=#404040]10[/color][color=#404040]秒内显深蓝紫色的视为阳性反应。也可以按照商品化氧化酶测试产品的说明书进行该项测试。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040]产氨实验（[/color][color=red]乙酰胺肉汤[/color][color=#404040]）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]原理：铜绿假单胞菌产生一种脱酰胺酶，可使乙酰胺经脱酰胺作用释放氨，滴加[/color][color=#404040]钠氏试剂（碘化汞钾），氨在碱性条件下与碘化汞钾作用，生成红色的络合物。[/color][color=#404040]• 操作：将纯培养物接种到装有乙酰胺肉汤的试管中，在36℃±1℃下培养20h～24h。然后向每支试管培养物加入1～2滴钠氏试剂，检查各试管的产氨情况，如表现出从[/color][color=red]深黄色到砖红色[/color][color=#404040]的颜色变化，则为阳性结果，否则为阴性。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040][img=,690,504]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810111959063912_4540_2166779_3.png!w690x504.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040]产荧光素实验（[/color][color=red]金氏[/color][color=red]B[/color][color=#404040]培养基）[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]原理：蛋白胨提供氮源，磷酸盐促进荧光素的产生并抑制绿脓色素的产生，硫酸镁为荧光素的产生提供必须的阳离子，琼脂是培养基的凝固。[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]操作：将上述呈红褐色的且氧化酶反应呈阳性的培养物接种于金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基上，于[/color][color=#404040]36℃±1℃[/color][color=#404040]恒温箱培养[/color][color=#404040]24h[/color][color=#404040]～[/color][color=#404040]5d[/color][color=#404040]。 每天需取出在紫外灯下检查其是否产生荧光性，将[/color][color=#404040]5d[/color][color=#404040]内产生荧光的菌落记录为阳性。[/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040][img=,690,515]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/10/201810112001313728_3277_2166779_3.png!w690x515.jpg[/img][/color][/color][/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040]计数结果说明[/color][color=#404040]• [/color][color=#404040]菌落计数公式：[/color][/color][/color][color=#404040]N[/color][color=#404040]＝[/color][color=#404040]P[/color][color=#404040]＋[/color][color=#404040]F([/color][color=#404040]cF/nF[/color][color=#404040])[/color][color=#404040]＋[/color][color=#404040]R([/color][color=#404040]cR/nR[/color][color=#404040])[/color][color=#404040][color=#404040][color=#404040][/color][color=#404040]- P[/color][color=#404040]是呈蓝[/color][color=#404040]/[/color][color=#404040]绿色的菌落数（所有证实为铜绿假单胞菌的菌落）。[/color][color=#404040]- F[/color][color=#404040]是没有绿脓色素但显荧光的菌落数。[/color][color=#404040]- R[/color][color=#404040]是呈红褐色的菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]nF[/color][color=#404040]是进行产氨测试的显荧光菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]cF[/color][color=#404040]是产氨阳性的显荧光菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]nR[/color][color=#404040]是进行产氨、氧化酶、金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基上显荧光测试的红褐色菌落数。[/color][color=#404040]- [/color][color=#404040]cR[/color][color=#404040]是产氨、氧化酶、金氏[/color][color=#404040]B[/color][color=#404040]培养基上显荧光测试均呈阳性的红褐色菌落数。[/color][/color][/color][color=#262626][color=#404040][color=#A53010]′[/color][color=#404040]样品稀释：[/color][color=#404040] [/color][color=#404040]若样品污染严重，建议对样品进行稀[/color][color=#404040] 释，如[/color][color=#404040]10[/color][color=#404040]倍递增稀释：取[/color][color=#404040]30ml[/color][color=#404040]样液加入[/color][color=#404040] 至[/color][color=#404040]270ml[/color][color=#404040]无菌生理盐水中，混匀，以此类[/color][color=#404040] 推，进行系列稀释。[/color][color=#A53010]′[/color][color=#404040]报 告：[/color][color=#404040] 结果以 [/color][color=red]CFU/250ml[/color][color=#404040]计。[/color][/color][/color]