新狼毒素对照品

近年来，在质量控制检测方面，制药技术有了重大改进和进步。其中一项检测是鲎试剂检测水和最终药品中的细菌内毒素，内毒素是一种有害的热原。传统的光度法鲎试剂检测——包括用于动态浊度法和动态显色法的96孔板检测——耗时且需要大量手动时间。现在，通过使用微流控技术，可以显著减少液体处理和手动时间，同时减少鲎试剂和样品量，并且保证合规性。合规化验需要多少鲎试剂？传统的鲎试剂检测使用96孔板，每个孔具有特定的形状和吸光度的路径长度。96孔板的路径长度根据制造商或厂商略有不同。这是因为平底96孔板上的孔通常是截头圆锥体，便于从模具中脱模。1由于孔的深度和形状，鲎试剂制造商规定了每个孔需要多少样品量和鲎试剂，以保持内毒素检测的1:1比例。动力学内毒素测定依赖于光密度（OD）变化和内毒素浓度之间的反比关系。OD是“用分光光度计测定的有机分子悬浮液或溶液在特定波长下吸收的光量”。2样品与鲎试剂的比例（1:1）非常重要。大多数鲎试剂制造商建议96孔板读数器和试管读取器使用100 µ L样品至100 µ L鲎试剂。有些鲎试剂使用的样品和鲎试剂少于100 µ L，这些鲎试剂通常在具有较小孔的微孔板中运行。然而，1:1的比例仍然保持不变。多年来，已证明这种1:1的比例可以准确地得出内毒素结果。使用100 µ L的样品和鲎试剂不是法规或药典的要求。相反，它是根据孔板或试管读取器的孔径大小、所需的路径长度和达到光密度的吸光度，给出使用多少体积（样品和鲎试剂）才能达到1:1比例的一项建议。微流控技术可以使用更小的反应体积进行准确、可靠和合规的内毒素检测近年来，鲎试剂检测出现了新的创新，如Sievers® Eclipse细菌内毒素检测仪。Eclipse利用微流控技术和向心力将小体积的液体准确地输送到微孔板上的特定部分，从而大大减少了所需的试剂量并简化了设置。30多年来，微流控一直是一个蓬勃发展的研究领域，因为它能够满足准确、经济高效、可靠和灵敏的化学和生物分析需求，而这正是内毒素分析所需要的。向心微流控用于鲎试剂测试Eclipse微孔板在五个区域中嵌入了不同浓度的标准品可制成标准曲线，每个浓度的标准品都有阴性对照。有21个样品区用户可以在一个板上运行多达21个样品，类似于96孔板读取器。每个样品区都含有阳性产品对照的内毒素。由于微流体需要较小的反应体积，但不会改变生物化学结构和特性，因此，将Eclipse微流控技术设计为使用比典型方法更少的鲎试剂，同时保证完全合规性。Eclipse的光密度是用比尔定律计算出来的。比尔定律，也称为比尔-朗伯定律，指出“化学溶液的浓度与其对光的吸收成正比。”3由于微流体的性质，包括流体通道和样品/鲎试剂室，Eclipse只需要1 mL鲎试剂，并确保每次测定的样品与鲎试剂比例为1:1。确保Sievers Eclipse的性能与传统的微孔板读取器相当在Eclipse的整个开发过程中进行了广泛的测试，以确保与96孔板读取器的性能相当。《美国药典》在一章中概述了验证分析方法时需要考虑的参数。Eclipse的系统性能是通过测定USP 中列出的不同参数来评估的。多年来，Sievers分析仪对来自多家厂商的多个鲎试剂批次进行了测试。除了鲎试剂水外，我们还在Eclipse和96孔板读取器上运行了药品样品。数据显示，Eclipse的性能与传统的微孔板读取器相当。总结即为，Eclipse使用符合药典的动态显色鲎试剂进行合规的细菌内毒素检测。根据USP 的验证数据表明，Eclipse相当于96孔板读取器。原文英文版刊登于《American Pharmaceutical Review》2023年5-6月刊，本文有所修改。参考文献Sievers Analytical Instruments. Determining equivalent onset optical density (OD) values on the Sievers Eclipse BET platform.McCullough, Karen Zink. The Bacterial Endotoxins Test: A Practical Approach. DHI Publishing, LLC, 2011.Helmenstine, Anne Marie. Beer’s Law Definition and Equation. Thought Co, 2019. https:// www.thoughtco.com/beers-law-definition-and-equation-608172◆ ◆ ◆联系我们，了解更多！

标准草案7月8日，国家药典委公示了槟榔标准草案，增订了赭曲霉毒素 A 检查项7月26日，国家药典委公示了黄芪标准草案，增订了赭曲霉毒素 A 检查项2025年版《中国药典》黄芪与槟榔的修订草案公示稿中对于供试品溶液的制备，与2020年版《中国药典》2351真菌毒素测定法中的赭曲霉毒素A测定法关于供试品溶液的制备有较大差异，差异见下表。标红部分为差异产品信息参考最新公示稿中的方法，采用岛津ShimNex CS C18和SHIMSEN赭曲霉毒素A免疫亲和柱可完成黄芪及槟榔中赭曲霉毒素A的测定。ShimNex CS C18（250mm×4.6 mm, 5μm，P/N：380-01230-01）SHIMSEN赭曲霉毒素A免疫亲和柱（3mL，P/N：380-00914）实验结果分析条件仪器配置：岛津高效液相色谱仪LC-20AD；色谱柱：ShimNex CS C18 (250mm×4.6 mm，5μm；P/N：380-01230-01)；免疫亲和柱：SHIMSEN赭曲霉毒素A免疫亲和柱，3 mL (P/N：380-00914)；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL-25 μL；柱温：30℃；流动相：乙腈-2%冰乙酸水溶液=49：51检测器：荧光检测器；激发波长 333 nm，发射波长477 nm色谱图完整实验结果请查看“岛津实验器材”微信公众号或直接访问：https://mp.weixin.qq.com/s/-MLzU1nalxAxJ0fhorMGyQ 25药典专栏 订阅方式具体步骤：1. 点击下方红色图片处订阅链接2. 页面跳转后点击“订阅”按钮订阅可及时获取25药典最新方案订阅提醒&报告下载如果您希望第一时间收到25药典专栏更新提醒，请点击或扫码填写问卷填写后可获取PDF版应用报告

在质量控制实验室中，最细致的检测之一是细菌内毒素检测。由于关系到患者的生命安全，因此内毒素检测非常重要。一次失败会导致成本高昂的重新检测、以及对不合规（OOS）结果的调查，甚至是大量的召回。挑战的另一方面是传统的内毒素检测单调乏味。通常情况下，进行传统检测的方法中充满了耗时且费力的步骤——而所有这些步骤对于实现内毒素检测的安全性和合规性都至关重要。为了确保对每个产品进行正确分析并确定产品可以安全使用，研究人员进行了许多计算和特性研究，以防止出现代价高昂的检测失败。以下是传统检测过程中遇到的一些挑战：▲计算内毒素限值和最大有效稀释度（MVD）▲方法适用性和产品验证▲鲎试剂的确效过去，内毒素检测并不像今天这样。多年来，它已经从家兔热原试验演变为今天最常用的动力学方法。现代实验室中最常用的动力学方法之一是动态显色分析法。在进行动态显色分析前，必须先完成几个步骤和检测，以确保产品可以用这种方法进行分析。这些步骤通常在开发和发布一种新产品、过渡到新的鲎试剂供应商或更改为新的药典方法时使用。计算内毒素限值和MVD必须先完成几次计算，才能确定如何分析产品并认为产品可以安全使用。计算内毒素限值、最大有效稀释度（MVD）和/或最小有效浓度（MVC）以确保产品不会对患者造成不良影响，并且可以按照法规要求进行适当的分析。美国药典USP ，USP ，AAMI标准和其他法规准则提供了确定这些值的公式和进一步指南。这些计算可以手动完成，也可以借助某些具有这些计算能力的内毒素软件进行。一旦确定，这些限值将成为产品生命周期中的一部分，只要不改变配方即可。要记住的一个重要注意事项是在这些计算过程中选择的检测的灵敏度。如果此灵敏度根据一个平台或标准曲线而变化，重新计算这些值以确保下一步使用正确的MVD十分重要。使用内置有计算内毒素限值和MVD软件的内毒素平台，将为实验室节省大量时间。方法适用性和产品验证研究发现大多数药品都会在一定程度上干扰（抑制或增强）细菌内毒素检测，但由于鲎试剂检测具有很高的灵敏度，通常可以通过在水中稀释内毒素来克服这些干扰。在计算出内毒素限值和MVD之后，必须完成一项研究以确定克服干扰（DROI）所需的稀释度。这项研究通常称为方法适用性或产品表征，它以高达MVD并可能包括MVD的多种稀释度分析产品。在此过程中，将密切监控阳性产品对照（PPC）的回收率，以寻找可能发生的任何潜在抑制或增强作用。PPC回收率用于确定待分析产品的最佳稀释度。应当使用每种稀释液的几份重复样来完成这项研究，以证明其可重复性，并考虑到微孔板制备过程中可能发生的任何误差。如果已经证明很难通过仅用水稀释BET来克服产品中的重大干扰，则可以采取以下措施：使用可替代的鲎试剂、热失活（在蛋白质存在下），使用特异的Tris或内毒素特定缓冲液，或用1 mM螯合剂（EDTA）稀释。一旦确定了DROI和潜在的样品预处理，就必须使用相同的鲎试剂供应商和方法对至少三个独特批次的产品进行检测，以确认其有效性。QC实验室通常会在软件外部跟踪对三个唯一批次的分析，但某些内毒素软件可以跟踪产品验证，查看每批经过验证的产品并签署产品验证。这些软件功能可以使结果井井有条且易于访问，从而加快验证过程。鲎试剂确效除了产品特性研究外，在建立并验证平台后，必须对所使用的鲎试剂进行确效。这至少要使用三种内毒素浓度，这些浓度要超过鲎试剂生产商所述的范围，每种浓度的至少使用三份重复样进行检测。必须对每批新的鲎试剂完成该检测，以确保其适合使用。无论是完成方法适用性测试、鲎试剂批次确认，还是常规检测，最耗时的步骤是微孔板本身的设置。要确保96孔微孔板或凝胶检测设置没有任何污染或移液错误，对精确度和专注度的要求非常高。对于传统的96孔微孔板，即使是最熟练的分析员，整个板的设置时间也可能需要一个小时以上。即使方法适用性基于生化基础，这种冗长的设置过程也会导致效率低下。检测一个样品需要用另一个鲎试剂供应商的配方来重复其适用性，这很容易将过程延长到几天或几周才能完成，而QC实验室可能没有这个能力。目前很少有创新的解决方案可以帮助QC实验室简化这一过程，但近期开发的先进的自动化功能可以大大节省时间和简化程序。一旦完成产品验证或鲎试剂确认，就可以建立常规检测方案，以简化每日和每周的检测需求。一些软件可以协助这一过程，使分析员能够创建检测模板，在登录后可快速访问，立即开始检测，从而减少设置时间并增加样品检测量。细菌内毒素检测看上去令人望而却步，需要遵循许多步骤，完成许多批次的检测以确认检测方法可行，而以上也仅是内毒素检测所要面对的挑战中的一个部分！还需要对分析员进行全面的培训，实验室必须进行正确设置和维护，且所有过程都必须把合规性放在首位。使用自动化和软件来减少内毒素检测的压力和负担，以减轻QC实验室内分析员和管理人员的日常工作压力。微流体自动化等创新技术通过减少移液步骤数量和培训分析人员所需的时间，大大提高了样品检测量。最终，通过提高样品检测量，可以在不浪费资源的情况下更快地验证产品。将微流体技术与简化的软件相结合，使QC实验室能够及时验证产品并进行鲎试剂确效，从而将实验室解放出来，满足其他关键检测需求。本文作者：Sydney Jannetta（Sievers分析仪生命科学产品应用专家），原文英文版刊登于《American Pharmaceutical Review》2021年1-2月刊，本文有所修改。◆ ◆ ◆联系我们，了解更多！