小鼠肾小球系膜细胞

飞纳 Pharos-STEM 在细胞生物学和病理学的应用一直以来，透射电镜（TEM）是观察和研究超微结构的首选工具，可用于观察整个细胞结构，包括细胞壁、细胞膜、细胞核和各种细胞器的变化，以及外源物质与细胞之间的关系等。不仅有助于许多重要细胞器的结构和功能的研究，而且有助于解剖病理学、血液学和微生物学等学科的病理诊断研究。 扫描透射（STEM）模式作为 TEM 的附加配件，可以显著提高生物样品的衬度，特别是未染色的组织切片。应对此类生物样品，TEM 操作人员通常也会选择相对较低的加速电压（80kV）来增加图像的衬度，并提高清晰度。但是由于其操作的复杂性，在对细胞生物学和病理学的超微结构的研究中，还没有被广泛应用（除专业的电镜中心外）。 飞纳台式场发射扫描电镜，体积小巧，具有低电压成像的优势，配备了新型的扫描透射（STEM）探测器后，可以结合扫描电镜和透射电镜的功能特点，在 15kV 的低加速电压下，就可以获得高分辨率的扫描透射成像。在观测电子束敏感的生物样品时，可以获得高成像质量图片。 以下为大家分享生物组织样品的制样方法以及 4 个使用 Pharos-STEM 拍摄的案例。（加速电压 15kV，工作距离 8.9mm） 具体过程如下：使用 2.5% 的戊二醇溶液（溶解于 PH 值为 7.4 的 0.1M 碳酸钠缓冲液中）进行固定，固定完成后，组织样品在碳酸钠缓冲液中清洗 1-2 天。这个过程具体包括使用 2% 四氧化饿清洗 4h，2% 醋酸铀清洗 1h，醋酸钠清洗 1h；然后使用梯度乙醇和丙酮进行脱水处理；接着按照标准配方使用低粘度环氧树脂 Spurr 进行包埋，将树脂在 70℃ 下固化 15h；最后使用超微切片机制备 70nm 厚的组织切片，将组织切片安装在 300 目的铜网上。接下来将具有样品的铜网放入 Pharos-STEM 中进行观测，结果如下。 案例一：被肾小囊（Bowman's capsule）包裹的正常肾小球 图1 小鼠肾标本样品（肾小球和临近的肾血管）的 STEM 图。红色箭头处可以看到含有红细胞的肾小球毛细血管，毛细血管被肾小球基底膜和足细胞的足突包围。 图1 为被肾小囊（Bowman's capsule）包裹的正常肾小球的超微结构。 STEM 图显示了正常肾小球毛细血管袢和肾小球系膜，与 TEM 下的微观图像类似。STEM 图中的红色箭头处清晰显示了肾小球基底膜、系膜基质、系膜胞质、足细胞足突的细节以及与基底膜毗邻的裂孔结构。STEM 图像显示了高分辨的超微结构，图像衬度明显，可以快速捕捉到极小的细胞变化，并快速分析感兴趣部位的微观结构。 案例二：正常的小鼠胰腺腺泡细胞 图 2 正常的小鼠胰腺腺泡细胞结构 STEM 图。图中显示了酶原颗粒（Z）、液泡、线粒体（M）、腺泡腔（L）和粗面内质网（R）。上图为胰腺星形细胞，下图为内质网的精细结构。 案例三：人类脑肿瘤组织 图 3 人类脑肿瘤组织 STEM 图。图中清晰显示了细胞的超微结构特征，髓鞘轴突、线粒体和嵴结构（M）、包含细胞间质纤维和囊泡的星形细胞结构（红色箭头处）。图中可以清晰观测到细胞结构和细胞器之间的关系。 图4 培养的全能干细胞的 STEM 图。晶状体上皮细胞内有大量的细胞质器，如线粒体和卵圆形细胞核。均质的细胞外观与早期细胞分化阶段的细胞相似（数据来自 ROR1e LECs）。图中可以清晰看到晶状体的微结构，包括靠近组织周围的晶状体上皮细胞，以及与之相邻的具有杆状细胞核的未成熟的晶状体纤维细胞，具有圆形细胞核的细胞和晶状体纤维细胞类似。 总结 通过以上 4 个案例，可以看出，使用配备 STEM 探测器的飞纳台式场发射扫描电镜，在观察生物类样品时，在较低的加速电压下，几分钟内便可以获得高衬度、高分辨图像。如您对此产品感兴趣，欢迎联系我们。 参考文献 Cohen Hyams T Mam K Killingsworth MC, 2020, ‘Scanning electron microscopy as a new tool for diagnostic pathology and cell biology’, Micron, vol. 130, pp. 102797 -102797, http://dx.doi.org/10.1016/j.micron.2019.102797.C. U., Devi, M. Masona, T. Cohen Hyams, M. C. Killingsworth, D. G. Harmana V. Gnanasambandapillai, L. Liyanage and M. D. O’Connor, ‘A simplified method for producing human lens epithelial cells and light-focusing micro-lenses from pluripotent stem cells’, Experimental Eye Research (2020) https://doi.org/10.1016/j.exer.2020.108317

单细胞转录组以及蛋白质组分析为获得健康和疾病相关细胞图谱提供了技术支持，也彻底的改变了对多种生物现象的解释。单细胞技术能够在高精度和高分辨率的水平上分析细胞状态。但是当前技术还不能够在动态的场景中捕捉细胞状态的转变。每个细胞的行为改变是遗传和信号网络共同作用的结果，因组织和细胞类型而异。2022年1月5日，来自西班牙国家心血管研究中心的Andrés Hidalgo 团队在Nature上发表题为Behavioural immune landscapes of inflammation 的文章。作者利用成像技术结合机器学习开发出实时细胞行为分析体系。作者首先使用CD11c-YFP小鼠，过继回输CFP+中性粒细胞，并用流感病毒PR8感染小鼠，对气管进行成像。作者总共提取了118个参数进行分析，这118个参数描述了单细胞的运动和性状特征。过滤处理后，生成了一个可视化网络图。通过筛选最能代表细胞行为的参数，作者选定了31个参数，包括19个动力学参数和12个形态参数。作者用31个参数生成了t-SNE图，显示了基于细胞行为的两个主要细胞群。作者进一步在多维度分析基础上确定最能区分各细胞群的特定参数。如细胞运动变化的速度比绝对细胞大小的参数更能预测细胞身份，这也表明行为变化中包含生物信息。作者用每个参数的可预测性强度改进了细胞预测网络，来推断在病毒感染模型中气管中特定的生物学特征。如中性粒细胞在DC附近移动较慢，而DC则表现出较高的同质行为。作者又利用皮肤缺血再灌注和激光烧伤模型测试了这些基于行为的分析模式。在缺血再灌注损伤模型中，三个细胞簇可以匹配三种细胞类型：中性粒细胞、DC和巨噬细胞。进一步子聚类分析可以识别两种中性粒细胞、两种类型DC和三种巨噬细胞。而在激光损伤模型中，作者能够利用参数分析模式更加精准区分中性粒细胞和DC。作者还发现了中性粒细胞以不同的行为模式涌向损伤部位。作者利用每个细胞数据中包含的位置信息将细胞投影到实际位置，以此构建行为图，试图实现个体特征与复杂行为模式的关联。这样的分析能够实现不同细胞分布可视化，同时能够通过实时成像捕获细胞行为，可以在其原生环境中分析细胞特征。炎症与中性粒细胞等细胞亚群特别相关，其中蛋白质或转录组变化都会影响炎症的结果。而细胞状态是细胞动态变化的基础。所以作者接下来用lyzM-GFP小鼠构建TNF诱导的血管炎模型，以此模型分析中性粒细胞状态变化。为了提高形态测量、动力学特征以及与血管壁距离测定的准确性，作者开发了一个基于机器学习的定制分析工具，它可以产生73个参数，准确描述血管内粘附细胞状态。作者总共发现了血管内三种细胞簇。分析发现第一和第三代表一个连续体的两个极端，第二种细胞簇代表血管内中性粒细胞的过渡状态。接下来作者使用24种突变小鼠。并利用以上分析模式对细胞状态进行分析。结果发现其中五种品系小鼠会出现抗炎表型，血管中中性粒细胞行为状态转换会出现不同变化。这表明细胞的状态调控开关主要由特定的信号通路组成，提高了靶向治疗以保护机体免受血管损伤的可能性。作者最后利用肾小球肾炎模型重点分析了Fgr这一分子对中性粒状态的调控。结果发现Fgr可以介导血管中中性粒细胞向致病方向转变。本文利用机器学习结合成像生成的数百种参数分析细胞行为状态变化，可以实现实时捕捉在原生环境中的细胞行为变化，并利用这一体系分析发现靶向特定免疫行为特征，具有治疗价值。原文链接：https://doi.org/10.1038/s41586-021-04263-y

质谱流式细胞术可在数百万个单细胞中同时采样并量化分析50多种蛋白质或蛋白质修饰水平。应用质谱流式可从全新的角度判别细胞种类、细胞表型，评估其功能状态和异质性以研究疾病发生和发展的机制。然而，作为一种新兴单细胞蛋白组方法，质谱流式因其技术特性也存有一些功能上的不足之处。目前该技术最大的瓶颈在于其灵敏度的极限，在单细胞中的每种抗原表位需要累积上百个金属标签标记的抗体才可在质谱流式分析中检测到特异性信号。灵敏度不足的问题，使得一些在人类疾病中至关重要的低丰度蛋白，如大量的转录因子、一部分细胞表面受体蛋白以及某些与特定功能相关的磷酸化位点难以被准确分析。在对小体积细胞，例如免疫细胞和微生物细胞的研究中，质谱流式在技术上则更具挑战性。而之前在多个不同实验室进行的放大质谱流式信号的尝试由于信噪比低、放大效果不强、可控性差等问题并没有获得显著效果。如何在不影响信噪比的情况下对质谱流式进行信号放大是一直以来亟待解决的问题。2024年7月29日，哈佛大学Wyss研究所尹鹏教授团队（伦小康博士、盛宽玮博士为共同第一作者）等在 Nature Biotechnology 期刊发表了题为：Signal amplification by cyclic extension enables high-sensitivity single-cell mass cytometry 的研究论文。该研究开发了一种名为循环延伸扩增（Amplification by Cyclic Extension，ACE）的信号放大技术，通过设计DNA动态探针实现对质谱流式技术（mass cytometry）中抗原表位金属同位素标记信号的高效放大，解决了质谱流式分析中的灵敏度瓶颈问题。ACE技术可同时放大30种以上蛋白表位信号。应用在悬浮质谱流式和成像质谱流式（imaging mass cytometry或IMC）中，ACE皆可大幅提升低丰度蛋白信号检测的灵敏度及准确性。在这项最新研究中，研究团队运用独特的DNA动态探针设计方法，创立了单链DNA循环延伸信号放大（Amplification by Cyclic Primer Extension，ACE）技术，实现了同时对多通道抗原表位信号的高信噪比高效放大，并应用于质谱流式技术上以大幅提高其灵敏度。ACE利用超短DNA序列作为起始探针（initiator）标记抗体并对胞内靶蛋白进行染色（图1）。在低温条件下，反应体系内的延伸探针（extender，含有两个相邻的起始探针互补序列）可互补结合在起始探针上，体系中的DNA聚合酶应用延伸探针为模版延长起始探针。提高体系温度后，延伸探针从延长过起始探针上解离，此时一个反应循环结束。当体系温度再次降低时，下一个延伸循环开始，起始探针进一步被延长。通过对起始探针序列的温控循环延伸，ACE可快速复制金属检测探针（detector）结合位点，引入检测探针后，单个抗体所携带的金属同位素标记物数量大幅提升。为提升DNA结构的热稳定性，该团队又结合3-cyanovinylcarbazole phosphoramidite (CNVK) 紫外交联方法将携带金属标记的检测探针共价结合在延伸后的起始探针上，使得检测探针在质谱流式仪内高温环境中不易解离（图1）。线型ACE（linear ACE）信号放大技术可平均提升信号13倍（图2）。但当分析极低丰度蛋白的单细胞信号或微生物单细胞蛋白信号需要更强信号时，可在线型ACE基础上应用分支ACE（branching ACE）以达到对抗原信号的500倍以上的放大。为配合质谱流式多维度蛋白表位分析特点，该团队通过设计正交DNA探针序列实现了对33种蛋白表位互不干扰的同时信号放大。图1. ACE技术流程示意图图2. 应用ACE逐级提高质谱流式抗原表位信号ACE技术建立后，研究团队首先将其应用与分析上皮-间质转化（EMT）和间质-上皮转化（MET）过程中的分子调控机制。通过对32个上皮和间质标记物、信号分子和转录因子的单细胞分析，将单个小鼠乳腺癌细胞从上皮状态到间质状态再回到上皮状态的转化过程进行时间重构，精准的展示细胞如何通过调节关键转录因子如Zeb-1和Snail/Slug的数量变化来驱动了EMT和MET分子程序。在第二个应用中，团队聚焦于单个T细胞胞内磷酸化信号网络。由于T细胞体积较小，在单细胞分辨率下每种磷酸化位点的表位数量有限，所以此前针对单个T细胞信号网络反应异质性的研究一直较难开展。团队应用ACE同时放大T细胞受体（TCR）信号网络内的30种关键磷酸化位点（图3），研究样本中T细胞在受到外部信号刺激时的胞内磷酸化网络特异性激活状态是如何分别调控介导应激、炎症、细胞增殖等反应的。应用该技术，团队分析了“组织损伤诱导T细胞麻痹”的分子信号机理，利用从手术患者获取的“术后引流液”（POF）样本刺激T细胞，并捕捉TCR信号网络的动态特征，揭示出导致部分CD4+ T细胞停止分裂并引起免疫抑制的胞内信号网络变化。图3. 应用ACE技术分析T细胞胞内信号网络动态变化最后，团队使用ACE结合成像质谱流式（Imaging mass cytometry，IMC）对人体肾脏组织切片中的蛋白表位进行高维度空间分析。通过检查从一名多囊肾病患者获得的肾皮质切片并对经信号放大后的20种肾脏标记物的空间表位分析，团队发现了存在于肾皮质部位细胞和组织结构的新病理特征：与组织修复相关的干细胞标记物Nestin在肾小球中的不均匀表达可能意味着组织的不同部位可能同时经历不同的病理阶段。ACE质谱流式信号放大技术是单细胞蛋白分析中一项革命性的突破。这套独特的生物技术在生物医学的各个层面都有着广泛的应用前景，尤其可将单细胞高维蛋白表位定量分析扩展到之前由于技术限制而从未涉及到的低丰度蛋白组。另外，结合成像质谱流式IMC，可在未来实现基于ACE信号放大的超分辨率空间蛋白组学成像分析。