宿主细胞残留检测试

现在国家药典对宿主细胞DNA残留要求 要小于100P克，儿童用疫苗更是要求严格限制在几十P克。现在国内对宿主细胞DNA残留去除技术似乎成为一个企业存亡的关键点啦。很多企业用凝胶4FF或者6FF柱子 ，单是都不能达到药典要求。个人认为：先通过离子交换柱，然后再通过凝胶柱可以去除大部分宿主细胞DNA。请从事这方面的同行讨论一下。

2015年3月底，第一个中国科学院和中国食品药品检定研究院联合开发的试剂盒出现在中国食品药品检定研究院网站的国家药品标准物质目录中：CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒（PCR-荧光探针法）。在2016年7月举办的生物制品研讨会上，中检院吕萍主任对这个试剂盒做了精彩的说明。这个由中检院与中科院联合研发，由生物制药企业参与标定的试剂盒与现行美国药典（USP）建议的检测方法同步，但与2010版药典附录中外源性 DNA 残留量测定法有所不同，将是国内生物制品的研发和生产的上下游企业检测宿主细胞DNA残留的第一选择,其后又联合开发了宿主细胞DNA残留样本前处理试剂盒,E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒,Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒,毕赤酵母DNA残留检测试剂盒,大大的方便的广大厂商的选择。产品优势:1:中检所参与开发并认可其质量2:灵敏度高,稳定性好3:高效回收微量dna,回收率70-130%4:操作快捷,整个过程只要4小时5:满足自动化操作要求,可以高通量检测 ,6:参考品溯源至中检所DNA国家标准品7:价格便宜,基本价格都在ABI公司价格的一半以下,大大节约了企业成本订货信息货号 品名 包装SK030203D100 宿主细胞DNA残留样本前处理试剂盒 100TSK030201c100 CHO宿主细胞DNA残留检测试剂盒 100TSK030202e100 E.coli宿主细胞DNA残留检测试剂盒 100TSK030204v100 Vero宿主细胞DNA残留检测试剂盒 100TSK030205p100 毕赤酵母DNA残留检测试剂盒 100T生物制品中宿主细胞残留DNA具有潜在致瘤和传染风险，所以各国药品监管部门对DNA杂质的限量要求非常严格。美国药典在General Chapter 介绍了三种常用技术，但将在2015年颁布的新版（USP38-NF33）中增加全新章节（General Chapter ）来进一步规范残留DNA检测的方法和标准物质。与1000号以上的章节不同的是，USP编号1000以内的章节详细规定了检测技术、系统适应性标准和标准物质。新版USP中将唯一推荐qPCR法作为生物制品中宿主残留DNA的标准方法。qPCR法的技术优势在于序列特异性高、灵敏度高、重现性好，可以为生物制药工业在工艺研究和成品质量控制方面提供可靠的检测手段。我国参照WHO、FDA和欧盟的标准，很早以前开始就对生物制品中残余DNA含量进行限制。从卫生部颁布的《人用重组DNA制品质量控制要点》到近年的《中国生物制品规程》都对DNA含量做了严格要求，部分标准高于国际标准。2010年版中国药典附录收录了DAN探针杂交法和荧光染料法，这两种方法都存在技术缺陷，很难达到杂质限量检测的灵敏度，已经被欧美药典摒弃。目前，仍有很多国内企业沿用这两种方法检测残留DNA，致使生产工艺和产品质量很难达到国际一流水平。根据残余DNA检测技术的发展趋势，小编预计我国2015版药典或增补版本中将出现qPCR方法。企业在生产与研发中采用中检院标准物质目录中提供的成套试剂盒，可以大幅度减少费时、耗力、成本高昂的方法学考察，只需开展少量方法适应性实验，就可以在生产工艺和质控体系的优化方面发挥实际作用，同时满足美国FDA相关标准的要求。同时，联合研发单位中科院湖州营养中心提供免费技术咨询和培训，帮助企业解决试剂盒应用中的各种技术问题。生物制品可用于治疗和预防疾病，关系到患者和健康人的用药安全，产品质量必须得到保障。我国药品监管部门对生物制品中残留DNA的限量标准制订的非常严格，但药典修订存在一定滞后性，附录中的检测技术与先进国家尚存在差距，企业在研发和生产中应具有一定前瞻性，否则会使改进工艺、提高质量、保障安全的努力大打折扣。为什么要检测残余DNA？生物制剂是制药行业中发展最快的领域，2014年全球十大畅销药中7个是生物制剂。这些销售在临床上疗效确切，但研发成本高，生产和质量控制要求非常严格。绝大部分生物制剂是不经过胃肠道直接进入体内，所以除了生物活性外，监管部门对药品中杂质的限量要求非常严格。其中，宿主细胞残留DNA因为具有特别的潜在安全风险，一直是国内外药品监管机构关注的重点。美国药典会从2011年开始就组织专门小组讨论修订生物制品中残留DNA检测方法，并在2014年Prescription/Non-Prescription Stakeholder Forum Meeting#5上宣布将在2015年药典修订版中增加新的章节（General Chapter ）来规范检测方法和标准物质。为什么美国药典会的专家组花几年时间讨论一个微量成分（100pg/剂量）的检测方法？还要专门增加章节来规范化？回答这些问题，先要了解它的来源和潜在危害性。生物制品中的重组蛋白药、抗体药、疫苗等产品是用连续传代的动物细胞株表达生产，虽然经过严格的纯化工艺，但产品中仍有可能残余宿主细胞的DNA片段。这些残余DNA可能带来传染性或致瘤性风险，比如残留DNA可能携带HIV病毒或Ras癌基因。分布在哺乳动物细胞基因组的LINE-1序列可能发挥逆转录转座子作用插入到染色体中，这种插入可能影响关键基因功能的发挥，比如激活癌基因或抑制抑癌基因。此外，由于微生物来源的基因组DNA富含CpG和非甲基化序列，增加了重组蛋白药物在体内的免疫源性风险。目前的研究结果显示，残留DNA的致瘤性相比传染性风险要低，但考虑到致瘤性实验是动物实验，传染性实验是在细胞水平做的，或许对两方面的风险都不能掉以轻心。众所周知，外源蛋白可能引起严重免疫反应，但关于残留DNA诱导的免疫反应的研究还不多。在一些临床前和临床研究中报道了高剂量的核酸样品，比如DNA疫苗或佐剂中的CpG寡聚核苷酸，可以诱导免疫反应，还诱导产生DNA抗体。生物制品中宿主残余DNA既是是生产中带来的杂质，还存在一定安全隐患。因此，WHO和各国药物注册监管机构一般只允许生物制剂中存在100pg/剂量以下的残留DNA。根据杂质来源和工艺，特殊情况下最高允许10ng/剂量。各种残余核酸检测技术的优劣正如前面讲过，2015年版的美国药典将新增章节对残余DNA检测进行规范化，那究竟和现有方法有什么不同？为什么最后只确定了一种方法？我们来看看现行美国药典对于残余DNA检测的总体要求。"因为残留DNA涉及到潜在来源（传染性病毒DNA）、管理规程等关键问题，药品监管部门建议必须建立产品的DNA残留检测方法。不论是否成品的常规检测包含DNA残留含量检测，还是工艺开发中已经证实了DNA清除率，残留DNA技术指标和定量分析监测规程都必须确立。分析方法包括杂交法、基于DNA结合蛋白的免疫色谱法（阀值法）、定量PCR（Q-PCR）或其他DNA扩增方法。理想的定量检测方法的灵敏度应该能够检测到约10pg/剂量的残留DNA。杂交法、阀值法和定量PCR方法因为灵敏度可以达到检测要求，所以属于经典方法。"下面我们引用美国药典（USP）的内容分别介绍一下这三种方法。杂交法（Hybridization-based）：在这种方法中，根据宿主DNA序列设计DNA探针用于测定产品中配对DNA的数量。双链DNA被变性成单链后固定在尼龙膜或硝化纤维膜上，DNA探针被放射或荧光随机掺入标记以后，与膜上固定的样品宿主DNA杂交结合，并在胶片或成像仪对应位置中显现斑点。对于荧光标记的探针，斑点的光密度结果可以在仪器中定量分析。斑点光密度对应结合在目标DNA上的探针数，进而推测出残留DNA的数量。通过目测方法可以半定量地检测样品中残留DNA，仪器读片可以对应斑点光密度绘制标准曲线，对应检测结果更加准确。DNA结合蛋白免疫阈值法（DNA-BINDING PROTEIN-BASED）：这种方法使用DNA结合蛋白和DNA抗体，分四步检测。第一步，通过加热把DNA变性成单链DNA，变性后DNA与偶联了亲和素的DNA结合蛋白以及偶联了尿素酶的DNA单克隆抗体混合反应，液相中的单链DNA、DNA结合蛋白、DNA抗体共同形成序列非特异的复合物。第二步，样品混合液通过生物素标记的膜，亲和素-生物素结合把DNA复合物固定在膜上，洗去非特异吸附。第三步，膜放入检测仪器中与尿素溶液反应，反应产物氨改变溶液pH值并被仪器记录变化。这种pH值的变化直接与样品中的DNA数目相关。第四步，仪器软件自动分析原始数据确定样品中残留DNA数量。定量PCR法（QUANTITATION PCR-BASED）：qPCR方法以其快速、高通量的特点已经被应用于生物制药的一些领域（拷贝数检测与病毒检测）。这项技术能够确定各种样品中目标DNA序列的准确数量。DNA探针的设计非常关键，这种DNA探针包含一端染料分子和另一端淬灭分子。当特殊设计的DNA引物引导DNA聚合酶沿着模板序列复制合成另一条对应序列时，DNA聚合酶切断结合在目标DNA上的探针染料端，释放到反应液里的染料信号被仪器测量。经过数十个循环的DNA扩增，荧光信号与起始DNA模板成对应关系，对应标准曲线可以准确计算出样品中残留DNA的数量。美国药典附录进一步对三种方法进行了应用评价。杂交法可以序列特异性地检测目标DNA，但32P标记的探针因为存在半衰期短、放射等问题，实际应用并不广泛。

据美国物理学家组织网报道，研究人员发现，在酸度出现变化的环境下，蛋白分子的结构将在原子水平上发生改变，引发病毒入侵并与宿主细胞发生融合。美国普渡大学和巴斯德研究所的研究小组分别研究了酸性环境和中性环境中的蛋白结构。结合两个小组的研究成果，能够说明病毒在进入宿主细胞并准备与之融合时蛋白质结构所发生的变化，而这恰恰是病毒感染的关键步骤。研究人员借助电子显微镜清楚观测到这种病毒表面蛋白质的3D结构，他们发现，蛋白质E1、E2、p62等在病毒入侵机制中发挥着关键作用。此前研究人员已经知道了包膜蛋白1（E1）的结构，仅知道包膜蛋白2（E2）的一般特征，如它在蛋白质复合体的位置，但还不了解它的结构。普渡大学研究人员现在已确定了E2的结构，以及E1、E2蛋白质复合体在原子水平上的精确结构。他们已经了解了E2的三种结构域，以及在酸性环境中，E2如何与细胞膜融合。E2是一种受体结合蛋白，病毒可附着其上进入宿主细胞。病毒在宿主细胞的酸性环境中引发蛋白复合物结构发生变化，从而可使病毒与细胞膜融合，形成一个“融合孔”，病毒可通过“融合孔”将遗传物质转移到宿主细胞，宿主细胞在感染病毒后会产生新的病毒粒子。普渡大学著名生物科学教授迈克尔·罗斯曼认为，这一发现具有里程碑意义，有助于人们掌握病毒如何感染人类和其他生物的相关知识，也有助于人们生产更好的疫苗和抗病毒药物。