核糖核酸酶来源于牛胰腺

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  • 【分享】生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用

    【分享】生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用

    生物质谱在糖蛋白结构分析中的应用项目完成人:桑志红 蔡 耘项目完成单位:国家生物医学分析中心 随着人们对糖蛋白参与生命活动机理的日益深入了解,对天然糖蛋白及重组糖蛋白类药物的分析越来越受到重视。重组糖蛋白类药物的质量控制更是直接关系到药物的疗效及至人类的健康。九十年代以来,随着带有反射功能的基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和纳升电喷雾串联质谱(nano-ESI-Q-TOF)等具有软电离方式的现代质谱 技术的发展,质谱以其高灵敏度和强有力的分析混合物的能力,提供了生物大分子的分子量、序列、一级结构信息以及结构转换、修饰等方面的信息,使糖基化分析有了重要的进展。 通常研究糖蛋白的方法是把蛋白链上的寡糖切下来,分别研究蛋白部分和寡糖部分的结构,因此无法研究与两部分共同相关的结构问题,也不能区分不同糖基化位点上切下来的寡糖。自90年代初,国外有人开始用质谱法研究糖蛋白的结构,同时描述了各个位点的不均一性。我们用建立的现代生物质谱技术研究糖蛋白一级结构的方法,将其应用与基因重组糖蛋白的结构分析。为糖蛋白结构分析及基因重组糖蛋白类药物的质量控制提供新的手段。一、 生物质谱研究糖蛋白结构方法的建立实验所用仪器为:1.德国BRUKER 公司的REFLEXIII型基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱仪,N2激光器,波长337nm,线性飞行距离150cm,加速电压2kv。2.英国Micromass 公司Q-TOF型电喷雾串联质谱仪。源温80°C,气体流速40L/h,枪头电压650V,检测频率2.4S,氩气碰撞池压力6*10-5mbar。1. 基质的选择,在MALDI-TOF-MS分析中,基质起着相当重要的作用。不同的基质对不同类的物质响应不同,a-氰基-4-羟基肉桂酸用于测定糖蛋白核糖核酸酶B效果相对较好。2. 糖蛋白分子量的测定,糖蛋白核糖核酸酶B由124个氨基酸组成,在34位Asn处连有一个高甘露糖型N-糖链。由于糖链的微不均一性,与普通蛋白质及核酸不同,其分子离子峰在MALDI-TOF-MS 质谱图上表现为一簇峰,各峰之间约相差一个糖基。正是由于这种微不均一性,使得其分子离子峰变宽,灵敏度降低。糖链分子量越大,峰越宽,灵敏度越低,所以一般只有糖链较短,蛋白的质量不太大的糖蛋白才能测定其平均分子量。用MALDI-TOF可直接测定糖蛋白核糖核酸酶B的平均分子量为 15208.6Da。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2011/03/201103211511_284179_1604317_3.jpg3. 糖含量的测定,采用O聚糖酶及内糖苷键酶F分别作用于核糖核酸酶 B,只有内糖苷键酶F能够是其分子量发生变化,表明核糖核酸酶B分子中不存在O-连接糖链存在着N-连接糖链。内糖苷键酶F切断N-糖链五糖核心最内侧的GlcNAc-GlcNAc糖苷键,得到含一个GlcNAc的肽链,减去GlcNAc,可以计算出准确的肽链分子量T=13695.6,与糖蛋白平均分子量之差为糖链的平均分子量G=1513.4,平均糖含量为:(糖链大小/糖蛋白分子量)×100%=9.95%。4. 糖基化位点的确定,研究糖基化类型及糖基化位点的策略:采用蛋白酶酶解与糖苷内切酶酶解相结合的方法,通过酶切前后含糖肽片的位移,结合网上数据库检索,可以确定糖基化类型和糖基化位点。以不同类型的糖苷内切酶作用于糖蛋白(N-糖苷键酶或O-糖苷键酶),在MALDITOF-MS 上观察其质量的变化,可以直接确定糖蛋白中是否含有响应类型的糖链,这是我们确定糖蛋白中糖苷键类型的基础。我们采用先将核糖核酸酶B还原烷基化,加Glu-C酶切,产物再用内糖苷肩酶F酶切,可观察到含糖肽段出现位移,将核糖核酸酶B的肽质量指纹图进行数据库检索,证实发生位移的肽段中含有N-糖链特异连接位点,由此确定34位Asn为糖基化位点。另外我们采用内糖苷键酶F及肽-N-聚糖酶F两种酶进行差位酶切法对含糖肽段进行验证,两种酶酶切后分子离子峰的差值除以GlcNAc的质量,结果就是N-糖基化位点的个数5. 质谱测定氨基酸序列, 我们对核糖核酸酶B肽质量指纹谱中的含糖肽段进行了串联质谱测定,首先在一级质谱图中选择离子4972.23,在串联质谱的碰撞活化室以氩气与其碰撞产生碎片,从碎片的质荷比推算出此肽片中的一段氨基酸序列,检索结果为核糖核酸酶B,从而判断其理论序列是否一致。6. 糖链结构的研究,凝集素对糖肽的亲和提取,进一步分析糖肽序列及糖链结构的关键是含糖肽段的提取。核糖核酸酶B中糖链为高甘露糖型,我们选用对其有特异性吸附的伴刀豆球蛋白对其进行提取利用这种简捷的亲和质谱的方法,对糖肽段进行了分析。建立了亲和质谱分析糖肽类物质的方法,为今后糖肽序列分析及糖链结构分析奠定了基础。二、基因重组糖蛋白人促红细胞生成素(rhEPO)的结构分析。 利用以上建立的方法,我们对样品重组人促红细胞生成素进行了分析,断定此样品为非完全糖基化,样品中只存在N-连接的糖链,无O-糖链。应用酶切法用肽-N-聚糖酶处理后,得到两个含糖肽段,进行数据库检索,测得38位及83位为N-糖基化位点,与文献报道相符,结果可靠。因此,该项课

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  • 首个新型冠状病毒核糖核酸假病毒弱阳性口腔粘液基质标准物质,重现临检样本全过程
    2021年6月4日中国计量科学研究院发布全球首个新型冠状病毒核糖核酸假病毒弱阳性口腔粘液基质标准物质(高浓度和低浓度)。▲规格:200μL/管(研制单位:中国计量科学研究院)新冠病毒核酸检测最常见的样品为咽拭子,但目前国内外尚未有以口腔粘液为基质的新型冠状病毒核糖核酸检测标准物质。通过模拟临床检验咽拭子样本的基质和病毒浓度,可最大限度地重现新冠病毒核酸临检样本检测过程,对咽拭子样品从RNA提取至核酸扩增检测的全过程进行质控,为新型冠状病毒检测实验室的弱阳性和位于灰区的检测结果提供判定参考,满足了国家卫健委新型冠状病毒肺炎实验室检测技术指南中的新型冠状病毒核酸检测过程质量控制的要求,并可用于新型冠状病毒检测试剂盒性能验证。该标准物质是采用重量法,将NIM-RM5203新型冠状病毒(2019-nCoV)假病毒核糖核酸标准物质添加到人工模拟的口腔粘液基质中制备而得。将重量法配制值作为标准物质ORF1ab基因和N基因的标准值。资源来源于:中国计量科学院。
  • 新发现!靶向单个分子的DNA酶让基因“沉默”
    美国加州大学欧文分校(UCI)研究人员开发出一种DNA酶,可区分一个细胞内的两条RNA链,并切割与疾病相关的链,同时保持健康链的完整性。这项突破性的“基因沉默”技术可能会彻底改变用于治疗癌症、传染病和神经疾病的DNA酶的发展。相关研究论文刊登于最新一期《自然通讯》杂志。一个信使核糖核酸(mRNA)的发夹环,绿色为核碱基,蓝色为磷酸核糖骨架。(图片来源:物理学家组织网)DNA酶是切割其他分子的核酸酶。利用酶让“基因沉默”技术已经存在20多年,美国食品药品监督管理局批准了一些药物,但没有一种药物能够区分RNA链中的单点突变,而UCI团队研制出的Dz 46酶可识别和切割特定的基因突变。Dz 46酶外表看起来像希腊字母Ω,通过加速化学反应起到催化剂的作用,其左右两侧的“臂”与RNA的靶区结合,组成的环与镁结合,并在一个非常特定的位置折叠和切割RNA,但其发挥作用非常依赖镁。为此,研究团队使用化学方法重新设计了这种DNA酶,降低了其对镁的依赖性。得到的Dz 46酶专门靶向KRAS基因内的等位基因特异性RNA突变,KRAS基因是细胞生长和分裂的主要调节因子,出现于25%的人类癌症中。研究人员表示,他们的研究结果表明,化学进化可以为开发多种疾病的新疗法铺平道路。他们计划进一步调整Dz 46酶,然后开展临床前试验。
  • Nature | 基因编辑工具箱或再添神器——TnpB核酸内切酶
    转座在生物体基因重塑过程中具有关键性的作用。IS200/IS605 和 IS607 家族的插入序列(insertion sequences, ISs)是最简单的可移动遗传元素之一,仅包含其转座和调节所需的基因。2021年9月9日,张锋团队在Science杂志上发表了一篇题为 The widespread IS200/605 transposon family encodes diverse programmable RNA-guided endonucleases 的文章(详见BioArt报道:Science | 张锋团队再发文:源于IS200/605转座子家族的多种核酸酶或可成为基因编辑新工具)【1】,重建了CRISPR-Cas9系统的进化起源,发现了3种高度丰富但功能未知的转座子编码的可编程RNA引导核酸酶:IscB、IsrB和TnpB,并对IscB的蛋白功能进行了详细探究。该研究还发现TnpB可能是CRISPR-Cas9/Cas12核酸酶的祖先,推测TnpB也具备RNA引导的核酸酶活性。近日,来自立陶宛维尔纽斯大学的Virginijus Siksnys团队(CRISPR开创者之一,通过研究CRISPR-Cas9 生化性质,得出了Cas9酶可以定点切割DNA的结论,特别致敬CRISPR幕后的英雄们——最全的一份CRISPR英雄谱)在Nature杂志上在线发表了题为Transposon-associated TnpB is a programmable RNA-guided DNA endonuclease的研究论文。研究人员通过一系列生化实验证实CRISPR-cas核酸酶的祖先TnpB是可重编程的 RNA 引导的功能性核酸酶。TnpB通过reRNA(right element RNA,长非编码RNA,来源于ISDra2转座子中的RE元件)引导去切割靠近TTGAT转座相关模块(Transposon associated motif, TAM)5’端的DNA,并可以切割人类基因组DNA。如图1所示,IS200/IS605家族的Deinococcus radiodurans ISDra2中包含tnpA和tnpB基因,以及位于两侧的LE(Left element)和RE(Right element)。在纯化TnpB的过程中,作者发现有许多RNA也被一同纯化。对TnpB结合的RNA进行small RNA测序(sRNA-seq)分析,发现它们大多是长度约为150nt的长非编码RNA,来源于ISDra2中的RE序列,作者将这些RNA称为reRNAs(right element RNA)。reRNA 3’端的16nt来源于IS200/IS605转座子的侧翼DNA序列,其余序列与TnpB基因的3’端和RE序列匹配,说明TnpB可以与转座子3’端来源的reRNA形成RNP复合物。图1. D. radiodurans ISDra2位点PAM(protospacer adjacent motif)序列是Cas9或Cas12核酸酶启动DNA切割所必须的,那么TnpB发挥作用可能也需要类似的序列。通过PAM鉴定实验【2】,作者观察到在目标基因5’端上游富集了大量的TTGAT序列,并称之为Transposon Associated Motif (TAM)。体外DNA切割实验证实TnpB具备RNA引导的靶向dsDNA的核酸酶活性。进一步分析发现,将TnpB序列中的RuvC-like活性位点突变后,TnpB失去了切割能力,说明RuvC模块与TnpB的活性相关。研究人员发现实现TnpB的DNA切割功能需要同时满足两个条件:(1)TAM序列;(2)与靶基因匹配的位于reRNA 3’端的序列。随后,作者对切割产物进行了测序分析,结果显示,TnpB采取的是一种交错切割模式,在NTS(non-target strand)的多个位置和 TS (target strand) 的单个位置进行切割,最终产生5’-悬挂端(overhangs)(图2)。图2. TnpB-reRNA复合物切割双链DNA的实验设计及流程最后,作者探究了TnpB在细胞内切割目标dsDNA的能力。首先,在E.coli中进行的质粒干扰实验表明TnpB可以在原核生物体内切割dsDNA。紧接着,作者想知道TnpB是否可以应用于切割人类基因组。将编码TnpB和reRNA的工具质粒转染至HEK293T细胞中,72小时后,提取基因组DNA(gDNA)测序分析目标切割位点中的序列插入和删除(insertions and deletions,indels)情况(图3)。实验结果显示,TnpB在两个测试靶点(AGBL1-2和EMX1-1)中引入突变的频率为10%-20%,这与之前报道过的CRISPR-Cas9和Cas12的效率类似【3-7】。进一步分析发现,切割位点引入的删除突变占主导地位,与Cas12切割谱中观察到的现象类似【5,7】。这些结果说明RNA引导的TnpB核酸酶可以切割真核生物的基因组DNA。图3. 利用TnpB编辑人类基因组综上所述,该研究从ISDra2系统中鉴定了一个新的具有dsDNA切割功能的核酸酶TnpB,其在原核和真核细胞中均能有效切割dsDNA,具有编辑人类基因组的巨大潜力。在进化树上,虽然TnpB与微型 Cas12f核酸酶的关系最为紧密,但作者认为两者之间依旧存在重大区别:(1)TnpB与Cas12f使用的guide RNA不同;(2)TnpB是单体,仅需要一个reRNA;而Cas12f 核酸酶是二聚体,需要结合一个拷贝的crRNA-tracrRNA duplex;(3)TnpB需要TAM序列,Cas12f需要PAM序列,两种序列截然不同。原文链接:https://doi.org/10.1038/s41586-021-04058-1

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  • 产品简介Medium touch系列以城市自来水为水源,可方便快速的制造RO反渗透水、DI去离子水和UP超纯水,在Medium的基础上进行了全面的系统优化和技术升级,集成触摸屏控制系统,增加双路定量取水功能,定位于为中心实验室、楼宇中央供水、中试车间、小型量产车间及相关用水量较大的领域提供纯水解决方案。现有Medium Touch-Q/S/RO/RQ/RS/1600Q/1600S 共7个子产品系列,系统产水量区间为:45-250升/小时,超纯水电阻率达到18.2MΩ.cm,完全符合GB/T 6682-2008、GB/T33087-2016、ASTM、CAP、CLSI、EP和USP制定的水质标准。特点与优势5.0寸彩色触摸屏,动画式菜单,实现指尖触控的操作新体验3路水质监控,实时监测源水、RO反渗透水、DI去离子水/UP超纯水水质,无需取水即可查看水质2路定量(10-999999ml)、定质(1~18.25MΩ.cm)取水功能超纯水循环系统可自由启动、关闭,保持系统的低细菌污染水平超纯水全管路消毒程序,可手动执行“循环消毒”、“取水口消毒”、“水箱补水”、“手动排污”、 “停止消毒”PP、KDF、AC、RO、UP、UF、TF、UV的耗材寿命可设定,可显示已使用时间,到期自动提醒更换系统时间设定(年/月/日/时/分)、定时待机(0~60min)、定时关机(0~24hour)功能缺水、水满报警,源水、RO反渗透水、DI去离子水/UP超纯水超标报警兼容压力水桶和液位水箱2种纯水储存方式,可直接显示水箱储水量,满足不同的应用需求工厂、客户二级密码,系统设置均由密码保护,防止未经授权的更改全自动RO膜防垢冲洗(可设定冲洗间隔时间和持续时间)及手动强制冲洗程序,延长RO膜使用寿命记录及随时查看耗材更换时间,全面掌握设备维护信息完善的信息查询及数据管理功能,全面掌控系统运行状态、水质、耗材使用、及时报警、历史报警等信息系统自带存储卡,自动记录一年的运行数据,可设定时间范围通过USB接口进行完整的数据导出内置2只15升压力水桶,节省实验室空间,安装维护更加方便,可加配外置大容量储水桶,满足不同水量需求不锈钢喷塑机箱,杜绝腐蚀和生锈,确保机体的清洁,符合GLP规范落地式设计,底部设有活动、固定支脚,安装、移动更加方便内部预留空间,可加装循环输送系统,作为中央供水设备使用。纯水管路、接头均获NSF认证优化的RO膜组件设计,采用美国陶氏DOW原装进口RO膜片,实现了RO膜的长寿命与高品质水质的结合大容量超纯化柱技术,实现少量树脂即可大幅度提升水质,采用美国陶氏DOW原装进口核子级树脂,时刻保证纯水品质双波长(185nm&254nm)UV紫外灯组件(进口灯管),有效杀菌,降低TOC,增强系统适用范围MWCO5000DUF超滤组件(原装进口),有效去除内毒素(即热原),可用于精密的细胞培养和IVF0.2μm进口PES聚醚砜复合滤膜终端除菌过滤器,保证水质无菌技术参数Pilot-Q去离子纯水机型号产水量电阻率电导率重金属离子 细菌颗粒物(0.2μm)Pilot-Q30045升/小时10-18.2MΩ.cm0.1-0.055 μs/cm0.1 ppb0.01 cfu/ml1/mlPilot-Q40063升/小时10-18.2MΩ.cm0.1-0.055 μs/cm0.1 ppb0.01 cfu/ml1/mlPilot-Q60094升/小时10-18.2MΩ.cm0.1-0.055 μs/cm0.1 ppb0.01 cfu/ml1/mlPilot-Q800125升/小时10-18.2MΩ.cm0.1-0.055 μs/cm0.1 ppb0.01 cfu/ml1/mlPilot-S超纯水机型号产水量电阻率重金属离子总有机碳(TOC)细菌热源颗粒物核糖核酸酶脱氧核糖核酸酶(内毒素)(0.1μm)(RNases)(DNases)Pilot-45、63、94、125升/小时18.2MΩ.cm@25℃0.01100.01N/A1/mlN/AN/AS300/400/600/800ppbppbcfu/mlPilot-45、63、94、125升/小时18.2MΩ.cm@25℃0.01100.010.0011/ml15S300/400/600/800UFppbppbcfu/mlEu/mlpg/mlpg/mlPilot-45、63、94、125升/小时18.2MΩ.cm@25℃0.0130.01N/A1/mlN/AN/AS300/400/600/800UVppbppbcfu/mlPilot-45、63、94、125升/小时18.2MΩ.cm@25℃0.0130.010.0011/ml15S300/400/600/800UVFppbppbcfu/mlEu/mlpg/mlpg/mlPilot-R双级反渗透纯水/超纯水机型号产水量其他纯水指标Pilot-RO30、45、60、90升/小时RO系列:30/45/60/90一级RO水(TDS):电导率≈源水电导率×5%,二级RO水(TDS):1-5μs/cm(电导率≤源水电导率×2%)有机物截留率99%(当MW200道尔顿);颗粒和细菌截留率99%Pilot-RQ30、45、60、90升/小时RQ系列:30/45/60/90电阻率:10-18.2MΩ.cm,重金属离子0.01 ppb,细菌0.01cfu/ml,颗粒物(0.2μm)1/mlPilot-RS30、45、60、90升/小时RS系列:30/45/60/90 UF/UV/UVF电阻率:18.2MΩ.cm@25℃,重金属离子0.01 ppb,细菌0.01 cfu/ml,颗粒物(0.2μm)1/ml,总有机碳(TOC) 10 ppb*** (UV/UVF型:TOC3 ppb***),UF/UVF型:热源0.001 Eu/ml,核糖核酸酶(RNases)1pg/ml,脱氧核糖核酸酶(DNases)5pg /ml*进水水质将影响纯水的质量和滤柱的寿命
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  • Milli-Q Reference A+ 技术指标和订购信息  如果需要,我们可以向您提供关于 Milli-Q Reference A+ 纯水水质达到 ASTM 、ISO 3696 和 CISI 标准对 1 级水的水质要求以及 USP和 EP 对纯化水的水质要求的合格报告。 进水技术规格参数数值和单位进水水质Elix 水、RiOs™ 水、蒸馏水或 DI 水,电导率 100μS/cm且 TOC50ppb进水连接/2 in Gaz M进水压力 *0-0.3bar进水温度5-35℃ Milli-Q Reference A+ 系统尺寸参数数值和单位系统占地面积1195cm2(185in2)系统尺寸(高 * 宽 * 深)497*332*360mm机箱带取水器的机箱713*413*458mm系统重量(带包装)19kg(41.88lb)系统重量(空)14.5kg(41.88lb)系统重量(进水)19.5kg(42.99lb)取水器取水回路长度750mm(29.52in)电源线长度290cm(114.1in)电源电压100-230V±10%  * 对于压力超过 0.3bar 的情况,需要在系统上游安装压力调节器 对于压力介于 0 和 -0.2bar 的情况,系统可以工作,但是产水流速会较慢。 产水水质参数数值和单位手动取水流速可在 50 和 2000ml/min之间调节定量取水体积100mL250mL 至 5L(每次增加 250mL)5L 至 60L(每次次增加 1L)定量取水准确度250mL 至 60L 准确度为 3%定量取水误差250ml 至 60L,C V3%电阻率 *18.2 MΩ.cm @25℃电导率0.055 μS/cm @ 25℃TOC**≤ 5 ppb(μg/L)TOC*****1 ppb(μg/L)细菌 ***0.1 cfu/ml热原(内毒素)****0.001 Eu/mL(无热原)核糖核酸酶 ****0.01 ng/mL(无核糖核酸酶)脱氧核糖核酸酶 ****4 pg/μL(无脱氧核糖核酸酶)
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    RNase Block 核糖核酸酶抑制剂是一种 50 kDa 的蛋白质,可特异性抑制常见的真核 RNA 酶,包括 RNA 酶 A、RNA 酶 B 和 RNA 酶 C。它是一种来源于分子克隆技术的重组核糖核酸酶抑制剂,通过非共价结合 RNA 酶分子,使 RNA 酶失活。 标准转录反应仅需 25 至 40 U监测内源性核酸外切酶和核酸内切酶活性。将 RNA 转录物与 40 U RNase Block 核糖核酸酶抑制剂在 37 ℃ 下温育 1 小时,并核实不存在降解,从而确定不含污染性 RNA 酶。应用:RNA 转录、体外 RNA 翻译、RNA 加帽以及可能存在真核 RNA 酶污染问题的任意应用RNase Block 不会抑制 RNA 酶 H、RNA 酶 T1/T7/T3 或 SP6 RNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、AMV 或 MMLV 逆转录酶该产品可根据您的需求进行定制。联系我们
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    RNase Block 核糖核酸酶抑制剂是一种 50 kDa 的蛋白质,可特异性抑制常见的真核 RNA 酶,包括 RNA 酶 A、RNA 酶 B 和 RNA 酶 C。它是一种来源于分子克隆技术的重组核糖核酸酶抑制剂,通过非共价结合 RNA 酶分子,使 RNA 酶失活。 标准转录反应仅需 25 至 40 U监测内源性核酸外切酶和核酸内切酶活性。将 RNA 转录物与 40 U RNase Block 核糖核酸酶抑制剂在 37 ℃ 下温育 1 小时,并核实不存在降解,从而确定不含污染性 RNA 酶。应用:RNA 转录、体外 RNA 翻译、RNA 加帽以及可能存在真核 RNA 酶污染问题的任意应用RNase Block 不会抑制 RNA 酶 H、RNA 酶 T1/T7/T3 或 SP6 RNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、AMV 或 MMLV 逆转录酶该产品可根据您的需求进行定制。联系我们
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