阿巴卡韦系统适用性混合物

通过 SFC-50对香豆素混合物进行分离纯化SFC应用”香豆素是一类具有广泛生物活性的天然产物，它们在医药、香料、染料和分析领域都有广泛的应用。香豆素及其衍生物因其抗肿瘤、降血压、抗菌等多方面的活性以及良好的光学特性而受到关注。在医药领域，香豆素被用于治疗多种疾病，如抗凝血药物华法令和新双香豆素。在香料领域，香豆素类衍生物用于洗涤剂、塑料制品等作为增香剂和定香剂。在染料领域，香豆素荧光染料因其高荧光效率和大的 Stokes 位移而受到重视。在分析领域，香豆素类荧光因其荧光量子产率高、Stokes 位移大、光稳定性好等优点，被用于荧光传感器分子设计。1简介香豆素混合物的分离挑战主要为色谱柱的选择：不同的色谱柱材料和粒径会影响分离效果。选择合适的色谱柱对于提高分离效率和分辨率至关重要。除此之外，传统的液相色谱分离可能涉及大量有机溶剂的使用，这不仅增加了成本，还可能对环境造成影响。本文提供一种通过超临界流体色谱（SFC）对香豆素混合物进行分离纯化的思路，快速筛选合适色谱柱的同时，由于采用大量 CO2 作为流动相，降低溶剂成本的同时也对环境保护做出贡献。2实验材料▲ 香豆素 7（C-7）5mg：吡喃香豆素(角型)，一种通常存在于自然界中的激光染料，它的衍生物用于医药和化学，也可用作 OLED 的掺杂材料。▲ 香豆素 334（C-334）5mg：吡喃香豆素(角型)，一种通常存在于自然界中的激光染料，合成半胱氨酸选择性荧光探针或pH指示荧光探针的起始原料。▲ 香豆素 4621（C-4621）50mg：自然界中发现的“简单”香豆素，合成抗凝血剂、抗炎剂和抗氧化超氧化物清除剂的前体。3实验设备Sepiatec SFC-50色谱柱：Dio,10x250mm,5umSilica,10x250mm,5umPEI,10x250mm,5umC18 ,10x250mm,5umCBD,10x250mm,5um2-EP,10x250mm,5um4实验条件分别将样品加载到 6 根不同色谱柱下，并在 20mL/min，柱温箱 40℃；背压 150bar 条件下运行，得到分离图谱如下：通过图谱不难看出，三个香豆素类化合物在 2-EP 色谱柱中分离表现最好。之后通过对改性剂进行调整，通过优化方法来改善分离度。最终确认方法条件：色谱柱：2-EP,10x250mm,5um流速：20ml/min柱温：40℃背压：150bar改性剂：15%甲醇等度洗脱5结论通过 Sepiatec SFC-50 快速筛选适合分离香豆素混合物的色谱柱与改性剂条件。15% 的甲醇用量相较于传统色谱法，极大降低有机试剂使用成本，并为后续大量制备打下基础。

王 芸 沃特世科技（上海）有限公司 蛋白质糖基化是生命系统非常重要的翻译后修饰之一，在免疫识别，蛋白分泌，信号转导等生命过程中发挥了重要作用。与蛋白相连的多聚糖是这些功能的重要载体，特别是对于单克隆抗体药物，多聚糖部分对药物的生物活性有着重要的影响。因此，发展分离效率高，检测灵敏度好的糖基化分析方法对单克隆抗体药物分析具有十分重要的意义。 针对糖基化分析中的种种困难，沃特世公司开发了亲水作用色谱法，以及荧光-质谱结合检测的分析方法。ACQUITY UPLC® 系统配合荧光检测器(FLR)以及多聚糖分析专用(GST )色谱柱，比HPLC方法有更高的分离度。多聚糖分析专用色谱柱装填了1.7&mu m的酰胺吸附剂，可在HILIC模式下有效分离荧光标记的多聚糖。UPLC® 配合荧光检测器分析多聚糖可以获得很高的分离度和定量准确性，特别是对于位置异构体以及有共流出的小峰分析；而质谱检测为糖链鉴定提供了更多的结构信息。通过与标准糖链保留时间的比较，该流程能实现高通量的多聚糖定性定量，满足药物分析的多种需求。 一、色谱条件与标记后的多聚糖样品的分离 可通过HILIC方法，有效分离2-AB标记的多聚糖混合物。对于方法优化，使用更缓的窄梯度，可有效提高保留时间上相临近的多聚糖峰之间的分离度；对于其它的参数，如流速、缓冲液浓度、流动相pH及柱温等，一般也需要进行优化。图1示例使用优化后的HILIC色谱条件后，复杂的2-AB标记的IgG多聚糖混合物得到了很好的分离，包括E1/ E2与F1/ F2。实验所用梯度洗脱时间为45分钟，包括色谱柱清洗和再平衡步骤。一般来说，一个样品的总分析时间在1小时内。因此，与使用3.0-&mu m填料的HPLC方法相比，使用1.7-&mu m填料的UPLC色谱方法，不但分离效果更好，而且运行时间更短。实验中使用2.1 x150 mm色谱柱。图1(B)中甘露糖5(峰C)与甘露糖6(峰H)可与邻近多聚糖峰成功分离，解决了共流出的问题。 二、2-AB标记的多聚糖定量及结构鉴定 由于多聚糖在HILIC 模式下能实现基线分离，各种异构体，例如末端唾液酸的位置异构，都能得到很好的分离。因此，在荧光检测器下的峰面积积分能对各种糖链进行定量分析。而从MS谱图来看，多聚糖样品中高甘露糖糖型所占比例较高，而复合型及杂合型糖链也都能够得到鉴定。各种带有神经氨酸的糖链也都能得到鉴定，表明该方法能够适合各种多聚糖复合物的分析。除了分子量，我们还能通过MS/MS谱图进一步确认多聚糖的结构。 2-AB标记的IgG多聚糖混合物的分析结果充分说明沃特世提供了成熟的聚糖分析方案，且相应色谱柱的质量控制采用了2-AB标记的IgG多聚糖混合物进行。ACQUITYUPLC系统显著缩短了分析时间，将常规HPLC上需要2个小时甚至3个小时的分离梯度缩短到1小时。 此外沃特世提供UPLC-FLR-MS的整体解决方案可以十分有效的对多聚糖进行分析，除提供分子量信息外，还可以进行糖结构推导，大大降低了生物药物研发工作中糖基化分析的难度。 实验流程： 一、2-AB 标记糖链 使用GlycoPro le试剂盒，Prozyme公司 使用试剂盒进行2-AB 标记糖链时，除以下步骤，按照该公司的说明操作即可。 1.使用50&mu l的标记反应液 2. 65度反应4-5小时 3.将样品按步骤4处理除掉过量的标记试剂 使用Sigma公司试剂 1. 配制3 0% 的醋酸D M S O 溶液（ 3 0 &mu l 冰醋酸，700ulDMSO） 2.按照20：1（v/w）的比例配制2-AB 溶液 （如需要20mg 2-AB，则用400&mu l 30% 的醋酸DMSO溶液配制） 3.以16.7：1（v/w）的比例将2-AB溶液与氰基硼氢化钠混合配制标记反应液 4.将所得糖链用50&mu l标记反应液溶解，65度震荡反映4-5小时 5 .将反应液按步骤4处理除去过量的标记试剂 二、使用MassPrep亲水作用样品处理板除去过量的标记试剂 所需溶液: MiniQ 纯水，90% 乙腈 ACN，10 mM 醋酸铵Tris，20% ACN 1.样品处理板活化，向样品处理板加入200&mu l MiniQ纯水，再加入 200&mu l 90% ACN，重复 90% ACN 2.吸取 50&mu l 标记溶液，加入 450&mu l ACN（ 如有沉淀，请勿离心，以免降低糖链回收率），由于板上每孔体积为200&mu l，可以将样品分为四份加入 3.将样品加入处理板，设定真空度为低（压力 250-500 mmHg），以保证样品与HILIC基质有充分时间相互作用；如果溶液在板上没有移动，可适当增加真空度 4.用 90% ACN清洗处理板两次 5.换用样品收集板，用200&mu l 10 mM 醋酸铵Tris， 20%ACN洗脱，洗脱液转移至1ml 离心管 6.冷冻干燥标记后糖链溶液冻干后的样品复溶于20&mu l50% ACN中，超声5 min 后转入UPLC采样瓶，进样5&mu l。 参考文献 (1) Martin Gilar, Ying-Qing Yu, Joomi Ahn, and Hongwei Xie.Analysis of Glycopeptide Glycoforms in Monoclonal Antibody TrypticDigest using a UPLC HILIC Column (2) Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skiltonand Jeffery R. Mazzeo. Separation and Characterization of N-linkedGlycopeptides on Hemagglutinins In A Recombinant Influenza Vaccine (3) Joomi Ahn，Ying Qing Yu and Martin Gila.r UPLC亲水相互作用色谱(HILIC)-荧光检测法分析2-AB标记的多聚糖

5月31日，欧盟委员会宣布采取行动研究不同化学物质组合的混合物引起的潜在影响。委员会指出日常生活中接触到各种化学物质组成的混合物可能对人体构成的健康危险非单一化学物质可比拟的。欧委会在2月份发布的报告中，总结了化学物质“混合效应”的现状问题： 　　1、特定的情况下，化学物质可能联合反应，影响毒性的整体水平 　　2、普通行为模式的化学物质会联合反应产生的组合效应可能高于单一成分产生反应 　　3、尚无充分的证据表明如果混合物中的单一成分在安全线下，混合物是否在安全阀值内 　　4、中高剂量水平下联合反应较为明显 　　5、化学物质混合物组合多不胜数，对人类和环境健康的影响难以逐一确定，考虑设定优先进行风险评估的混合物清单(priority mixtures) 　　6、对化学物质混合物的评估缺乏暴露数据，目前紧紧掌握了少量化学物质的作用方式信息。 　　欧盟法规严格限制可用于食品、饮用水、空气和产品生产中的特定化学物质的含量，然后对这些化学品组合产生的混合效应却鲜有研究。当前欧盟立法的一个状况是一门法规通常只针对一个特定的领域，比如植物保护产品、农药、化妆品、药品、兽药等。在不同产品中的同一种(类)化学物质成分受不同的立法监管，这就为协调并使风险评估一致性构成了障碍。 　　欧委会提出的新方法，将识别一批需要优先评估的混合物，确保这批物质在欧盟不同法规风险评估要求上的一致性，弥补科学数据鸿沟。这个方法论主要与化学物质组合作用的行为方式、暴露数据，将研究控制在可进行正确评估的程度上。从这个方法论出发采取的行动必须基于减少、改善和取代脊椎动物实验的原则。为了推动化学物质累积效应的评估，委员会做了以下承诺： 　　1、成立一个特别专家小组，小组成员由来自欧洲化学品管理署(ECHA)、欧盟环境署(EEA)、欧盟食品安全署(EFSA)的代表组成，咋欧盟不同的法律条文下综合评价需优先进行风险评估的混合物的对人体和环境暴露的健康风险 　　2、2014年6月编制出科学技术指引，促进“需优先评估混合物”风险评估方法的一致性 　　3、帮助理解化学混合物是如何暴露于人类和自然环境的。这个需要从欧盟法规数据监管或者通过欧盟基金支持进行相关研究计划并构建化学监管收据收集的平台 　　4、增加其他知识空白领域的研究途径，诸如化学物质的组合作用形式、分“类”组物质研究、交叉参照法的应用 　　5、推动全球范围内化学物质混合效应研究方法的一致性和科学性 　　详情参见： 　　http://europa.eu/rapid/pressReleasesAction.do?reference=IP/12/541&format=HTML&aged=0&language=EN&guiLanguage=en