人膀胱移行细胞乳头瘤细胞

肿瘤干细胞在肿瘤细胞的发生、自我更新、耐药性和转移中扮演着重要角色。作为泌尿系统最常见的恶性肿瘤——膀胱癌干细胞(Bladder Cancer Stem Cells)的起源和遗传学基础目前仍不明确。　　中国科学院生物物理研究所蛋白质科学研究平台抗体工程实验室李翀与中国科学院微生物研究所、深圳大学的研究人员合作，采用单细胞测序技术对肿瘤干细胞进行基因组学层面的探索，并进行了功能性实验验证。　　科研人员采用膀胱癌特异性抗体BCMab1与CD44抗体组合，从3份新鲜的膀胱癌组织中分选膀胱癌干细胞(Bladder Cancer Stem Cells)、膀胱癌非干细胞(Bladder Cancer Non-Stem Cells)、膀胱上皮干细胞(Bladder Epithelial Stem Cells)和膀胱上皮非干细胞(Bladder Epithelial Non-Stem Cells)，共计59个细胞进行了单细胞MALBAC扩增和全外显子测序。　　通过进化分析发现：膀胱癌干细胞起始于膀胱上皮干细胞或膀胱癌非干细胞。对膀胱癌干细胞中发生突变的21个关键基因进行鉴定后发现，有6个基因未曾在膀胱癌中报道(ETS1，GPRC5A，MKL1，PAWR，PITX2，RGS9BP)。ARID1A，GPRC5A和MLL2联合突变可显著增强“膀胱癌非干细胞”转化成“膀胱癌干细胞”能力。　　这一研究成果利用单细胞MALBAC扩增技术结合全外显子测序技术详细描绘了膀胱癌干细胞的基因组学概况，实验性证实了“膀胱癌干细胞”起源于“膀胱癌非干细胞”这一科学问题，揭示了人类膀胱癌干细胞起源的遗传学基础，阐明了癌变细胞中关键突变(Driver mutation)如何调控膀胱癌干细胞的自我更新机制，对于人类膀胱癌的防治具有重要意义。　　这一研究成果分别以Single-cell sequencing reveals variants in ARID1A, GPRC5A and MLL2 driving self-renewal of human bladder cancer stem cells 和Reply from Authors re: Xue-Ru Wu. Single-cell sequencing reveals variants in ARID1A, GPRC5A and MLL2 driving self-renewal of human bladder cancer stem cells 为题发表在国际泌尿科学学术刊物《欧洲泌尿学》(European Urology)上。前者的第一作者是中科院生物物理所李翀和微生物所杨昭，深圳大学教授吴松是通讯作者。后者的通讯作者是李翀和杨昭。　　该研究得到了国家自然科学基金资助。　　　　 　　图示：膀胱癌单细胞水平的系统进化分析。图A：膀胱癌干细胞与膀胱癌非干细胞的进化分析。图B：体细胞突变关键基因。图C：单个细胞体细胞突变频率。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 消化道相关病毒对人体健康产生重大威胁，尤其是乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒，在中国有数量庞大的患者。乙型肝炎病毒感染者无论在潜伏期、急性期或慢性期，其血液都具有传染性。临床上主要通过注射乙肝疫苗来达到预防的目的。一旦感染乙肝，目前治疗方案主要有NUC治疗，而NUC治疗只能干扰DNA合成，并不能将乙肝病毒从患者体内清除，因此具有很高的反复性。丙型肝炎病毒（慢性感染）为一类致癌物。临床丙型肝炎病人50%可发展为慢性肝炎，甚至部分病人会导致肝硬及肝细胞癌。非常遗憾的是医学界尚未研制出有效预防丙肝的疫苗。因为丙肝病毒是RNA病毒，极易变异，研制疫苗的难度很大。质谱流式在这两种病毒方向的应用主要涉及到临床治疗方案的改善，疫苗的效价评估及潜在治疗靶点的探索。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 消化道相关病毒 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 目前质谱流式在消化道相关病毒的研究主要集中在轮状病毒，乙型肝炎病毒HBV和丙型肝炎病毒HCV三种病毒领域。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 轮状病毒（ rotavirus）肠炎是由轮状病毒所致的急性消化道传染病。病原体主要通过消化道传播，主要发生在婴幼儿，常由A组轮状病毒引起，发病高峰在秋季，故名婴儿秋季腹泻。B组轮状病毒可引起成人腹泻。轮状病毒领域目前已发表文献涉及到T细胞结合表位筛选和寻找轮状病毒特异性B细胞亚群。T细胞结合表位筛选利用新发现的质谱流式和MHC四聚体技术相结合，创建了一种高通量筛选的技术。该技术用金属标签替代四聚体上的荧光基团，进而可以用质谱流式进行检测，从根本上解决荧光串色问题，提升单次检测通道。加之他们用三金属组合的方式标记四聚体来取代传统单金属标记的方法，进一步增加筛选的通量，用10种金属就可以实现120种抗原肽的筛选。利用该方法，Newell等人对人体内轮状病毒的109个MHC四聚体上77个T细胞潜在结合位点进行筛选，在健康个体的血液中鉴定出6个限制于人白细胞抗原（HLA）-A *0201的T细胞表位。值得一提的是，研究还发现特异性结合轮状病毒VP3蛋白的T细胞具有独特的表型，并在肠道上皮中大量存在。轮状病毒相关B细胞研究中，Nair, N.等人在轮状病毒上标记金属离子，进而研究在肠道中特异性结合在轮状病毒VP6结构性蛋白的B细胞亚群特征，揭示肠道B细胞组成异质性及其与肠道分泌细胞之间的关系。这些研究揭示出轮状病毒感染后抗原呈递及免疫反应特征，对于今后轮状病毒治疗及疫苗研发提供重要的理论基础。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HBV相关研究涉及到感染进程及临床治疗两个方向。利用上述质谱流式和多肽-MHC四聚体技术的结合，Cheng, Y.等人对不同阶段HBV患者体内T细胞进行HBV基因组中HLA-A*1101限制性484种T细胞潜在结合位点进行了筛选，最终发现特异性结合HBV(pol387)和HBV(core169)表位的T细胞随着疾病发展呈现出明显分化和异质性。根据这些T细胞表型变化，作者绘制出HBV疾病进展图谱。如此深入的研究对于今后HBV感染阶段分型及治疗策略有很好的指导意义。临床治疗方面，Rivino, L.等人利用质谱流式探索HBV感染后NUC治疗停止治疗判定标准。发现患者体内是否存在功能性HBV-特异性T细胞亚群可作为慢性HBV患者停药的潜在生物标志物。慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的慢性炎症增加了肝细胞癌（HCC）的风险。但是，关于HBV相关HCC的免疫状况及其对有效癌症免疫疗法设计的影响知之甚少。Lim, C. J.等人利用免疫组化和质谱流式技术，对HBV相关的HCC和非病毒相关的HCC的免疫微环境进行了细致研究，找到HBV相关HCC的独特免疫亚群，结合患者预后信息，作者发现Treg与HCC的预后不良相关，而Trm与HCC的预后良好相关。这种深入的研究对今后HCC的治疗和免疫疗法的适当应用具有重要意义。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HCV感染全球数以百万计的人，是肝硬化和肝细胞癌的主要原因。而针对丙型肝炎病毒（HCV）的保护性疫苗仍未满足临床需求。已有成果利用质谱流式对新研发HCV疫苗疗效进行评价，单次实验可分析更多的免疫亚群反应。Doyle, E. H.等人用质谱流式对HCV感染后肝脏中的pDC功能进行分析，发现pDC是肝脏中唯一的单个核细胞，依旧具备多功能性，可大量分泌IFNα等多种细胞因子。可在今后治疗方案改善中作为潜在靶标。这些研究对于临床均具有重要的应用和指导意义。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 人乳头瘤病毒（HPV） /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " HPV感染会引发的宫颈癌和口咽鳞状细胞癌。质谱流式对两种肿瘤免疫微环境的研究发现。虽然是同一种病毒感染，但是由于组织类型的不同，其免疫微环境呈现出很大的差异性。这说明组织类型会显著影响肿瘤中的免疫渗透概况。这对治疗方案的调整有很大的指导意义。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 口咽鳞状细胞癌的可分为HPV阴性和HPV阳性。质谱流式对这两种类型患者的综合免疫亚群分析结合临床情况，发现患者肿瘤内存在I型HPV16特异性T细胞会提升其整体生存率，缩小肿瘤大小，减少淋巴结转移。并且会改变肿瘤微环境，使其呈现出响应标准治疗的特征。这些发现说明在口咽鳞状细胞癌中引入HPV16特异性T细胞会提升治疗效果。对临床治疗具有很大的启发。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 小结 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 本文对质谱流式在消化道相关病毒和人乳头瘤病毒方向的文献进行汇总，所列文献涉及到的应用方向如下：1、病毒感染T细胞识别表位筛选，2、疫苗评估，3、确定疾病分型标准，发现biomarker的研究。在这些应用方向，质谱流式的单细胞多通道检测有其不可替代的优势。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 2013年开始兴起的技术——质谱流式与多肽-MHC四聚体技术相结合——在近两年呈现出越来越多的高水平成果。得益于质谱流式的单细胞多通道检测，利用该技术在筛选T细胞表位的同时，还可以对抗原特异的T细胞进行多参数的表型和功能分析；一次得到更多更准确的病毒特异性T细胞及抗原呈递信息，这对疫苗的研发有着举足轻重的作用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 疫苗研发和效价评估方面。疫苗注射后所引起的免疫反应也是全方面的。能够评估的免疫亚群越全面，对于效价的评估越准确。质谱流式在这方面有其得天独厚的优势。从最开始的抗原表位筛查到注射疫苗后免疫反应的评估，质谱流式都可以大大提升覆盖度，使得研究更加快速，结果更加准确。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 综上，质谱流式在：1、病毒感染T细胞识别表位筛选，2、疫苗评估，3、确定疾病分型标准，发现biomarker的研究领域都有着传统流式无法比拟的优势，可助力研究人员在单次实验中拿到更多的信息，对免疫系统进行更加综合全面系统的评估。 /p p br/ /p

导读在女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，而大多数宫颈癌是由人乳头瘤病毒(HPV)感染所致。目前已分离出的HPV达100多型，其中至少14型可导致宫颈癌或其他恶性肿瘤。全球范围内，大多数的宫颈癌中可测出高危型HPVl6和18亚型，其中HPV16亚型诱发癌变的潜力最大。东西分析基于飞行时间质谱技术平台成功开发出40多种HPV分型的应用方案，为临床提供早期宫颈癌的精准诊断，并为治疗提供准确的参考建议。人乳头瘤病毒(HPV)，是一种乳头瘤空泡病毒，女性患病率通常高于男性。部分类型的HPV感染是宫颈癌的高危因素。感染后主要累及人体的皮肤和黏膜，可分为低危型和高危型。高危致癌型HPV分布于α属第5,6,7,9,11五个种。高危型HPV感染是宫颈癌、口腔癌、直肠癌、食道癌等恶性疾病的危险因素之一。而在在女性恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，大多数宫颈癌是由HPV感染所致。已分离出的HPV达100多型，其中至少14型可导致宫颈癌或其他恶性肿瘤。全球范围内，大多数的宫颈癌中可测出高危型HPVl6和18亚型，其中HPV16亚型诱发癌变的潜力最大。HPV基因分型检测的意义HPV的感染在治疗前后，可能存在型别的差异，这可以作为医生治疗效果的评估指标；连续两次HPV分型检测显示单一型别的高危亚型的感染，显示宫颈癌发生的可能性增大；HPV的感染在不同的地区，占主要地位的型别有所不同，分型检测有利对于各地研究、使用疫苗进行HPV感染的预防控制。因此，HPV基因分型检测能够：确认感染危险程度 极高危型HPV16型感染会在几年内发展为宫颈上皮内瘤变三级（CIN3）+至浸润性癌，而非致癌型HPV61的感染，持续很长时间也不会发展为癌。确认是否持续感染高危型持续感染是导致宫颈癌的最主要因素。大多数HPV感染在1-2年内可清除，当间隔一年以上、连续两次以上检测出同一种或组HPV基因型时，被认为是持续性感染。若第一次HPV检测结果阳性，很难确定感染的时间。从感染HPV到发生宫颈癌最少需要8-10年的潜伏时间，连续检测可以有效避免错过治疗纠正的机会。识别传染源人所感染的HPV与感染源的基因型相同。可以使用安全措施及共同治疗和检测进行，有助于持续性感染纠正。疫苗接种指导 只要没有感染疫苗覆盖的类型，接种都是有益的。目前HPV 技术检测面临的问题L1靶标基因整合后脱落漏检现有的技术平台，几乎所有的HPV检测产品均以L1为靶点。无法避免病毒进入细胞后从游离态变为整合态，L1基因脱落，导致恶变样本漏检。动态范围窄，高危低载量出现漏检以目测法和荧光法定性的检测，动态范围窄。当多基因型混合感染时，无法检出高危低载量HPV病毒，导致高危致癌型漏检。致癌高中危型未全覆盖，造成漏检目前试剂盒无法同时检测IARC在2012年提出的2B类以上27个致癌HPV基因型，从而导致中危致癌型漏检。应用核酸质谱技术进行人乳头瘤病毒(HPV)分型检测的优势对高危型采用致癌基因E6，极高危HPV 16/18型采用E6/L1双基因，从而避免病毒基因整合造成的假阴性，能够最大限度避免出现漏检；高灵敏度：可扫描超过40种HPV基因型。特异性PCR扩增+探针单碱基标记，以分子量分型，灵敏度达个位拷贝，超宽动态范围超过9个数量级。能够防交叉反应以及防扩增污染，从而有效避免假阳性。高通量：每天可检测上千个样本。东西分析经过多年的开发，基于飞行时间质谱技术平台成功开发出40多种HPV分型的应用方案---能够同时快速检测出超过20种高危和低危致癌及常见致疣HPV型以及超过20种可能致癌和低危致疣HPV型。能够有效避免恶变样本漏检和假阳性，从而为临床提供早期宫颈癌的精准诊断，并为治疗提供准确的参考建议。Ebio Reader 3700 Plus飞行时间质谱仪操作简单无需复杂的样品前处理。性能稳定长寿命固体激光器；飞行管随环境温度、湿度的变化小，保证检测的稳定 ；高效网筛离子源，提高仪器的灵敏度 ；PIE高压脉冲电源控制，实现离子的延迟推斥，提高整体仪器的分辨能力。软件智能基于神经网络聚合分类法的人工智能软件；拥有强大数据库，实现对菌种的实时鉴定；具备聚类分析功能，可进行T-test等数据分析；具有自建库功能，可根据用户实际情况建立自有菌种库 ；可根据用户具体需求，进行相应升级，用于疾病蛋白标志物和核酸基因分型的检测。应用范围广广泛用于临床、疾控、食品安全、农业、工业、出入境检疫等领域。往期回顾BREAK AWAY核酸质谱之漫话一：什么是核酸质谱核酸质谱之漫话二： 核酸质谱法鉴定结核病及其耐药性