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发现另类DNA修复机制 被烷基化或脱氨基的DNA碱基,在一个保护基因组完整性、但同时又会干预癌症烷基化疗法的过程中被DNA糖基化酶(修复酶)清除。迄今所研究的DNA糖基化酶采用一个被修饰的碱基插入活性点的机制。现在,最近发现的DNA糖基化酶AlkD的结构已被确定,并且也显示了一个非常不同的机制。按这种机制,被修饰的碱基从一个“螺旋外”位置伸出,这个位置只使N3- 和N7-被烷基化的碱基发生解理。DNA与AlkD的串联HEAT重复段的相互作用使DNA 骨干发生扭曲,从而使“非Watson–Crick碱基对”能够被检测到。AlkD酶在细菌、古细菌、植物和真核生物中普遍存在,这便提出了一个有趣的问题:为什么消除基因组烷基化损伤会有另一种机制?
[img=,500,111]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808020953386500_4907_981_3.png!w690x154.jpg[/img]1 同时利用4个光阱模拟DNA-蛋白质相互作用的示意图。[b][/b]分子水平研究DNA修复机制DNA修复是人生命活动中最基本的过程,识别和修复DNA损伤的机制复杂而精细。没有DNA修复机制,细胞就丧失了转录其基因组重要区域的能力,从而导致有害突变的累积,最终使细胞受到损伤。DNA损伤的来源主要包括双链断裂和DNA内部发生交联,如不及时修复,最终会发展为恶性肿瘤。深入的研究DNA的修复,单分子水平的技术手段必不可少。然而,既要在体外模拟体内的生物学行为,还要达到足够的灵敏度和分辨率,在原来是几乎不可能的。LUMICKS公司采用最新技术——C-Trap™ 可以满足实时可视化单分子水平观测DNA修复过程中DNA与DNA修复相关蛋白的相互作用。在保证高度模拟体内环境的前提下,大大提高了灵敏度和分辨率。尤其是当C-Trap配置了STED (超分辨显微镜,SuperC-trap™ )之后,直接观察单个蛋白分子的动态变化成为了可能。上图表示:一个DNA分子被两个由光镊控制的微球拉直,多种DNA修复相关蛋白与DNA相互作用。通过共聚焦显微镜可以实时定位荧光标记蛋白的位置,因此可以用来研究蛋白的结合位点、扩散、折叠/去折叠等一系列蛋白与DNA互作过程。同步进行的“力-距离”信号检测能够将蛋白的活性和酶动力学结合起来,反映DNA-蛋白复合物的力学特性。[img=,500,92]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808020954417480_4675_981_3.jpg!w690x128.jpg[/img]2 X轴为时间,Y轴为沿着DNA的结合蛋白的定位。图像显示实时监测DNA修复过程中DNA与蛋白的相互作用。[img=,200,158]http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2018/08/201808020955450482_5351_981_3.jpg!w252x200.jpg[/img]3 DNA修复相关蛋白 XLF (红色) 、XRCC4(绿色) 和复合体(黄色)在DNA上的精确位置。C-TrapTM可以实时观测DNA与蛋白质的相互作用,包括DNA的修复、复制、转录和发卡结构的形成。DNA双链由两个光镊控制的微球拉直。通过荧光显微镜可以精确定位荧光标记的蛋白,实时观测与DNA修复相关的蛋白所参与的生物学反应。Figure 2 显示DNA修复相关蛋白XRCC4(绿色,占总量的9%)和XLF(红色,占总量的62%),这两种DNA修复相关蛋白参与到非同源末端连接(NHEJ)修复过程中并形成XRCC4-XLF复合物(黄色,占总量的29%)。XRCC4和XLF还参与DNA桥联过程,此实验需要通过额外添加两个光阱。利用四个捕获微球可拉伸两条双链DNA,通过光镊施力模拟细胞内非同源DNA与DNA末端相互连接的过程。然后与DNA修复相关蛋白共孵育,检测出何种蛋白参与DNA的修复。Figure 3 显示2个DNA双链与200 nM XLF和200 nM XRCC4共孵育,过段时间后DNA形成了桥联结构。可以发现2个DNA双链形成四聚体的桥接结构的确需要这两种蛋白介导。然后通过对微球施力可进一步证实桥联的稳定性,研究应力状态下DNA修复蛋白的生物学特性。比如:当向右上和右下微球施加高强度的力(100pN)时,XLF-XRCC4 DNA 修复蛋白复合体将会结合到左侧的DNA上,启动非同源末端连接(NHEJ)修复模式。继续增加施力,当施力大于250pN时,桥联出现明显的断裂,反映出这种修复方式的桥接具有高度的稳定性和韧性。这种4微球双DNA模型技术是首次应用到DNA修复领域相关实验中。此外,由于DNA修复过程经常发生于蛋白高度密集的微环境中,因此结合STED超分辨显微镜也是一种区分标记蛋白和损伤DNA分子的技术手段。
肌肉能提供干细胞来促进肌肉的生长和受伤肌肉的再生,但肌肉干细胞必须驻留在特殊的部位才能有助肌肉的生长和修复。德尔柏林布吕克分子医学中心(MDC)发育生物学家Dominique Bröhl和Carmen Birchmeier教授已经阐明这些干细胞是如何定植于肌肉干细胞“巢穴”中的。肌肉干细胞也被称为卫星细胞,位于平滑肌细胞的质膜和周围基底层之间。可发育分化为成肌细胞,后者可互相融合成为多核的肌纤维,形成骨骼肌最基本的结构。http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201209/2012091813042153.jpg在本研究中,Bröhl博士和教授Birchmeier表明,小鼠的肌肉祖细胞缺乏Notch信号后,不能定植于干细胞“巢穴”。相反,肌肉祖细胞会定植于肌纤维之间的组织中。发育生物学家认为,这是肌肉弱化的原因。干细胞定植于错误的地方就不再像以前那样拥有多种生物学功能,难以有助于肌肉生长。此外,Notch信号通路在肌肉的发育过程中具有第二大功能。它可以通过抑制肌肉发育促进因子MyoD防止干细胞分化成肌肉细胞,从而确保肌肉中总会存在能保存有修复和再生功能的干细胞“巢穴”。这项工作对肌肉再生和肌肉无力的研究具有重大意义。这实验势必为肌肉严重损伤和肌肉萎缩的患者提供新的希望!多么希望此技术能在中国普及。