细胞破壁

近期，北京林业大学材料学院许凤教授团队在植物细胞壁拉曼光谱大数据处理技术上取得新突破。该技术成果构建了基于主成分分析的植物细胞壁拉曼光谱聚类分析方法，相关研究成果“Method for Automatically Identifying Spectra of Different Wood Cell Wall Layers in Raman Imaging Data Set”发表在《Analytical Chemistry》上。该期刊为美国化学会旗下国际分析化学领域顶级期刊，最新影响因子5.636，五年影响因子5.966。　　拉曼光谱成像技术具有信息丰富、制样简单、对样品无损伤等特点，近年来已成为研究植物细胞壁局部化学的重要工具。然而，拉曼光谱分类技术落后，严重制约了光谱数据的深入挖掘及科学运用。传统的分类技术通过导出实验数据进行手动分析，不但费时费力，人为因素干扰严重，更会造成数据浪费，甚至丢失重要信息。针对这一问题，许凤教授团队经过探索创新，基于细胞壁超微结构特点，率先采用数学统计学结合自主研发的计算机程序分析处理植物细胞壁拉曼光谱数据，建立了快速分辨细胞壁不同形态学区域拉曼光谱的新方法。该方法能够根据植物拉曼光谱的自身特点，对所获海量拉曼光谱数据进行自动、准确、快速分类，将为植物细胞壁化学组分拉曼光谱定量研究提供理论依据。论文投稿期间，审稿人一致评价该方法创新性突出，对生物质相关领域的研究具有重要意义。　　发表在《Analytical Chemistry》上的论文第一作者为北京林业大学材料学院林产化学加工工程学科2014级博士研究生张逊，论文发表获得国家杰出青年科学基金的资助。目前，在许凤教授的指导下，张逊正开展基于该技术的相关研究，希望在植物细胞壁拉曼光谱的定量分析上能有新的突破。

德国ibidi的ibiPore可以实时观察流动、剪切情况下的细胞侵袭、迁移、细胞相互作用等实验。对实验结果进行观察统计时，不需要将膜取下，也不需要将另一边的细胞擦掉（经常将膜擦破，导致实验失败），可直接将μ-Slide放于显微镜下观察统计。细胞可以通过两种方式，选择贴壁于氮化硅膜的上下两侧。可以把细胞种植在膜下边，避免自由落体的说法，大大提高了实验的准确性。21世纪注定是一个生命科学的世纪，科研工作者们如果想在这个世纪去决胜，能做到一点，不仅要好的idea，领先的技术，更需要得心应手的好工具。所谓工欲善其事必先利其器，今天为大家介绍德国ibidi的μ-Slide ibipore SiN (图1), 一款具有多孔氮化硅膜的μ-Slide载玻片，可用于实时观察流动、剪切力条件下的细胞侵袭、迁移以及细胞相互作用的可视化的“ transwell ”，更多应用请参阅文中（Intended Use的相关内容）。图1. ibipore及ibipore SiN氮化硅膜培养细胞的染色结果。图片背景为在ibipore氮化硅膜上培养细胞的荧光染色结果，规则排布的白色圆点为氮化硅膜的孔隙ibipore有上下两个独立的通道（见图2），两个通道 overlap 的区域由一个孔径大小均一的氮化硅膜隔离开（见图3）。两个通道可以分别培养细胞，通过两种方式，细胞可以贴壁于氮化硅膜的上下两侧。在细胞侵袭实验中，普通的transwell只能将细胞培养在上侧，这样所得到的实验结果并不能明确的说明是由于重力作用还是侵袭能力本身造成的。而ibipore考虑到这一因素，建议实验者在氮化硅膜的下侧进行细胞培养，检测细胞向上侧通道进行迁移的能力，进而巧妙的排除了重力作用对侵袭实验的影响。配合ibidi流体剪切力系统以及加热孵育系统，可以在流动、剪切力条件下实时的观察细胞的侵袭以及迁移等实验。德国ibidi公司为满足不同实验的需求设计了不同孔径的氮化硅膜（见图4）。ibipore与传统的transwell实验最大区别有三点：①. ibipore可以在上下两个通道中培养细胞，这样可以观察细胞向上的侵袭情况，排除以往实验中重力作用的影响；②. ibipore中间的氮化硅膜具有良好的光学特性，可以实时成像观察侵袭情况，也可以进行免疫荧光染色实验；③. ibipore可以配合ibidi流体剪切力系统，观察淋巴细胞等在流动状态下的侵袭情况。ibipore产品介绍ibipore产品特点：* 透过薄而多孔的薄膜获得卓越的光学性能* 有着广泛的应用，细胞可完全粘附到顶部-基底* 对于不同细胞类型有多种孔径大小可以选择应用：1.流动状态下跨内皮细胞迁移2.2D或3D凝胶内细胞层的共培养和传输分析3.顶部-基底细胞极性分析4.顶部-基底梯度的细胞屏障模型分析5.细胞迁移分析（例如，用于研究肿瘤侵袭或转移）在μ-Slide ibiPore IV型胶原涂层3μm孔径中人类内皮细胞的免疫荧光染色，相位对比度、DAPI（蓝色）、VE钙粘蛋白（绿色）和F肌动蛋白（红色）的叠加图像。技术特点：1.SiMPore的微孔氮化硅膜2.中间具有多孔光学膜的跨通道结构3.优异的光学性能，堪比盖玻片4.孔径大小0.5μm，3μm，5μm，8μm供选择5.中间膜0.4µ m（400 nm）6.使用工作距离0.5mm的物镜7.与ibidi泵系统（流体剪切力系统）完全兼容8.下部通道中明确的剪切力和剪切速率范围µ -Slide ibiPore SiN工作原理µ -Slide ibiPore SiN由插入两个通道之间的水平多孔膜组成。上部通道是膜上方的静态储液池。下部通道是灌注通道，用于对附着在膜上的细胞施加限定的剪切应力。上部通道和下部通道仅通过隔膜彼此连通。图2. ibipore组成示意图多孔膜由氮化硅（SiN）制成，这种材料具有非常高的化学和机械稳健性。400nm厚的氮化硅膜非常适合成像和显微镜观察，没有任何自发荧光或透明度问题（如玻璃）。SiN材料可以直接用于贴壁细胞培养，也可以选择用ECM蛋白包被。应用建议：孔径 & 孔密度什么是孔密度孔密度是指膜的空隙体积分数。是孔隙的体积除以膜的总体积。下面的图形为采用相同的放大倍数。图3. 不同孔径的氮化硅膜不同应用的建议孔径：不同的细胞大小和直径不同，根据具体实验请选择不同孔径图 4. 为不同应用推荐的不同孔径的氮化硅膜Intended Use经证实的应用这些应用已由ibidi研发团队或者我们的用户进行过试验。Endothelial Barrier Assays内皮屏障分析在膜一侧培养单层细胞。细胞可以在静止或者流动剪切力条件下培养。Co-Culture and Cell Barrier Assay共培养和细胞屏障分析在膜的两侧分别培养单层细胞。通过这种方法可以进行信号传递、共培养以及迁移实验（例如，分析药物通过上皮或内皮屏障的传递）。Apical-Basal Cell Polarity Assays顶端-?基底端细胞极性分析3D凝胶基质中的化学因子可以导向在膜另一侧培养的单层细胞的极性发生。Potential Use潜在应用以下示例将讲述该产品进一步的潜在应用。ibidi仍需在内部测试这些应用，因此我们无法提供特定的实验方案。但是，从技术角度来看，这些应用应该是可行的。Trans-Membrane Migration in 2D/2D跨膜迁移在膜的一侧培养单层细胞。可以观察悬浮的白细胞在流动状态下的滚动、粘附以及侵袭情况。Cell Transport in a 3D Gel Matrix细胞在3D凝胶基质中的传递3D凝胶基质中的细胞迁移：在流动状态下，观察白细胞的滚动、粘附以及向3D凝胶基质中肿瘤细胞方向的迁移情况。Application Examples 应用实例MDCK和NIH-3T3细胞的相差显微镜观察Madin-Darby犬肾（MDCK，左）和NIH-3T3（右）细胞在μ-Slide ibiPore SiN，孔径0.5μm的玻片中，无蛋白质包被。接种后，将细胞在静态条件下在培养箱中保持20小时。相差显微镜，4倍物镜。请注意，这张图像中的中心多孔区域看起来更暗，因为0.5μm的孔隙无法用低分辨率物镜分辨。流动条件下HUVECS的相差显微观察人脐静脉上皮细胞（HUVEC）在μ-Slide ibiPore SiN中，孔径3μm的玻片中，有纤连蛋白包被。将细胞接种并在具有ibidi泵系统/流体剪切力系统的流动条件（10达因/cm2）下在培养箱中保持12小时。固定后的相位对比显微镜，10倍物镜。流动下HUVECs F肌动蛋白细胞骨架的荧光显微镜观察人脐静脉上皮细胞（HUVEC）在μ-Slide ibiPore SiN，孔径5μm玻片中的免疫荧光染色，有纤连蛋白包被。将细胞接种并在具有ibidi泵系统/流体剪切力系统的流动条件（10达因/cm2）下在培养箱中保持12小时。绿色：肌动蛋白（鬼笔肽），蓝色：细胞核（DAPI）。荧光显微镜，20倍物镜。选择指南：ibidi跨膜分析实验解决方案参考文献：Salvermoser, Melanie, et al. "Myosin 1f is specifically required for neutrophil migration in 3D environments during acute inflammation." Blood, The Journal of the American Society of Hematology 131.17 (2018): 1887-1898. 10.1182/blood-2017-10-811851Rohwedder, Ina, et al. "Src family kinase-mediated vesicle trafficking is critical for neutrophil basement membrane penetration." Haematologica (2019). 10.3324/haematol.2019.225722Non-Recommended Applications不建议的应用因技术原因，本产品不适用于以下应用，应避免使用.本产品不适用于：1.上通道灌流2.两个通道的灌流3.跨膜流动4.筛选应用订购信息

p　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "近日，浙江大学方群团队联合北京大学黄超兰团队在单细胞蛋白质组学分析研究领域取得了突破性进展。/span此项成果近日以全文形式在线发表于美国化学会的Analytical Chemistry杂志上(影响因子 6.32)，论文题目为“Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis”。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/0d88aade-7372-4d68-b5da-4d57efa64b73.jpg" title="001.jpg" width="650" height="478" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 650px height: 478px "//pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "strong图：纳升级油-气-液滴(OAD)芯片和自动定位(SAM)装置的结构示意图(a)和用于单细胞蛋白质组分析的样品前处理和上样的全流程图(b)。/strong/span/pp　　蛋白质组学是后基因组计划之一，也是近年来的热点研究领域。作为生命体内功能直接执行者的蛋白质，和基因相比在揭示生命发育和疾病的发生发展的机制方面有更重大的意义。近年来，基于细胞群体内的蛋白质组学研究，因为不可避免地会将大量细胞内的信息平均化，已经越来越难以满足对生命功能更加深入探究的需要。从单细胞层面去了解细胞特征以及彼此之间的相互影响，可以为生物系统中细胞间的异质性提供更宝贵的信息，因此有着越来越大的迫切需求。span style="color: rgb(0, 112, 192) "鉴于蛋白质不具有直接扩增的特性，以及蛋白质组学分析灵敏度的限制，目前对于少量乃至单细胞内蛋白质的检测在技术上还是极具挑战的。/span/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "单细胞内蛋白质含量极少，就典型体细胞而言仅为0.1- 0.2 ng，远远小于常规蛋白质组学样品前处理所需要的微克级蛋白量。/span并且细胞内的蛋白质通常需要在离心管内完成复杂多步的前处理操作，包括细胞裂解和蛋白质释放、蛋白质沉淀纯化、蛋白质还原和烷基化、酶切等，一个全细胞裂解蛋白质组的最后反应体积均是几十甚至过百微升，在这个蛋白质组学常规前处理的过程中，由于样品与离心管的接触、多步的样品转移和不完全上样等原因，在进入质谱之前不可避免地带来了蛋白质的损失。用此流程来处理单细胞，即使之后结合液相色谱仪器的自动进样阀可以以小于十微升的体积完成上样也无济于事，因为尚未等到分离蛋白质样品就有可能已经损失大半了。/pp style="text-align: center "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/ce546442-97dc-4a87-a243-558d62afe43e.jpg" title="003.png"//pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "如果说单细胞蛋白质组学是在米粒上雕刻，那么两个团队就是造出了适合在米粒上雕刻的工具刀。/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "该项研究起自2014年，两个团队的研究人员协同合作将微流控液滴技术与蛋白质组分析技术相结合，发展了一种微型化的油-气-液“三明治”芯片及相应的纳升级液体操控和进样方法，能够在原位静态的纳升级液滴中完成少量细胞蛋白质组学分析所必需的多步样品前处理操作，并且实现了将液滴样品直接高效地注入到色谱分析柱内完成后续的液相色谱分离与质谱检测。/span通过采用优化后的芯片材料、裂解试剂、酶切比例和色谱质谱参数等实验条件，该芯片系统可以分别成功地从100、50、10和1个HeLa细胞内鉴定到1360、612、192和51个蛋白质。更重要的是，研究人员首次实现了以单个鼠卵母细胞为初始样本的蛋白质组学分析，一共鉴定到355种蛋白质，其中存在一系列与生殖发育(Ovgp1和Pabpc1)、疾病相关(AnxA6，Kpna2，Cct6a和Pcbp2)的基因。在该工作中，还采用两种常规的基于离心管的前处理方法进行了对照实验，实验结果明确证实了微流控液滴体系具有更低的样品吸附损失、更高的酶切效率和更高效的疏水性蛋白质鉴定能力等明显优势，更适用于微量蛋白质样品的蛋白质组学分析。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "此项研究带来三个突破/span：首先是成功发展了适合进行单细胞及类似微量样品的蛋白质组学分析样品前处理芯片和方法。芯片内550 纳升的液滴与芯片的接触面积仅为常规离心管模式下的十五分之一，显著减少了样品与反应器接触所带来的损失；二是发展了一种实现纳升级液滴的直接进样方法，利用3D打印加工的自动定位装置和高压气泵高效地( 99%)将液滴样品注入到分析色谱柱内，完全避免了样品转移和经过液相仪器内复杂管路带来的损失；第三是为避免在常规微流控液滴系统中由于油相直接接触液滴而造成的缺陷，提出了一种采用气相来间隔液滴相和油相的新型液滴芯片结构，在成功防止液滴明显蒸发的同时，还避免了油相和液滴相直接接触带来的脂溶性样品的损失，也使系统能更方便地进行后续的分离柱进样、色谱分离和质谱检测。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "该项研究在基于质谱的单细胞及微量样品的蛋白质组学分析方面开启了全新的技术，其所具有的系统结构简单、容易搭建、操作方便、可靠性高等特点，使其有望被广泛应用到细胞间异质性的研究以及与临床相关的研究，包括稀有的循环肿瘤细胞分析、生殖细胞相关研究和疾病诊疗等方面，因此在未来具有巨大的持续开发和应用转化前景。/span/pp style="text-align: center "span style="color: rgb(0, 112, 192) "img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201805/noimg/91e71d83-0fde-4b69-8b5f-10de6af33876.jpg" title="未命名_meitu_0.jpg" width="400" height="400" border="0" hspace="0" vspace="0" style="width: 400px height: 400px "//span/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "（左上：浙江大学/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "教授/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "方群、/span/strongstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "右上：/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "北京大学/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "教授/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "黄超兰、/span/strongstrongspan style="color: rgb(0, 112, 192) "左下：/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "浙江大学博士生李紫艺、/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "右下：前国家蛋白质科学中心· 上海高级工程师/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "黄敏/spanspan style="color: rgb(0, 112, 192) "）/span/strong/pp　　该论文的第一作者为浙江大学博士生李紫艺，通讯作者为浙江大学化学系微分析系统研究所方群教授和北京大学医学部精准医疗多组学研究中心主任黄超兰教授。工作得到了国家自然科学基金和中国科学院杰出技术人才项目的支持。黄超兰教授的部分工作在前单位中科院国家蛋白质科学中心· 上海完成，特此鸣谢!/pp style="line-height: 16px "img src="/admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif"/a href="http://img1.17img.cn/17img/files/201805/ueattachment/b0d2802c-066e-4fdf-86c9-b683f1c317de.pdf" style="color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 112, 192) "Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis.pdf/span/a/ppspan style="color: rgb(0, 112, 192) "文章链接：/spana href="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" _src="https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661" style="color: rgb(0, 112, 192) text-decoration: underline "span style="color: rgb(0, 112, 192) "https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.analchem.8b00661/span/a/p