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PCR技术具有高度的特异性、选择性、灵敏性,而且快速、简便、易于自动化,因此在临床医学工作中受到广泛的重视及合理的应用。目前在我国许多基层医疗单位均已相继开展PCR研究用应用工作。PCR技术很简单,原理也很清楚,因此有条件的单位都能较顺利地上马,但毕竟PCR技术是一种新生事物,受到许多条件因素的影响,所以要做得好也不容易。在PCR技术应用过程中会遇到这样或那样的问题,更甚至会得到与事实完成相反的结果。为了使我们能够顺利地开展PCR工作,更好地发挥PCR技术的工具作用,我们根据多年来PCR工作总结的经验,对PCR扩增过程中经常出现的一些问题进行简要的总结,提供给广大科研工作者作为参考,抛砖引玉,不足之处欢迎指正。 一、 假阳性扩增 在实验过程中有时会碰到所检验的样本全部阳性,而且扩增产物电泳条带亮度均一,这是扩增系统受到污染时最典型的一种表现,需仔细检查,排除污染源,一般应从以下步骤着手: ⒈ 试剂污染: 厂方提供的试剂或其中的某种组分在出厂或运输、贮存过程中受到污染。检测方法,可按试剂盒说明书将试剂分装好,直接置于PCR仪中扩增(不加阴性对照,可加适量蒸馏水),便可简单而有效地判断试剂是否已受到污染。 ⒉ 实验室污染: 这是最常见的污染源,由于PCR技术可以在几个小时内将模板中某些特异性序列扩增到数百万倍以上,扩弗产物可能在电泳等过程中污染[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]、操作台或随着蒸发所形成气溶胶而污染整个实验室。扩增产物又是最有效的模板,一旦出现产物污染其污染程度都较严重。判断方法:可以将实验中最关键步骤如试剂分装、样品处理等转移到一个新的环境中或转移到超净工作台中完成。当然,所用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]、吸咀管(离心管)都应彻底更换。解决方法:实验室污染是PCR扩增过程中最易出现的现象,而且一旦出现污染,消除污染源又极其困难,往往需对整个实验室及实验器材彻底清洗处理,所以应该以预防为主,实验过程中严格遵守实验基本要求,样品处理与扩增产物及电泳应尽量分开,最好能在两个房间进行。扩增前处理所用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]及扩增后点样用的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液器[/color][/url][/color][/url]应严格地分开,不可互换。PCR室应保持良好的通风、清洁、最好能专用。 ⒊ 采样污染: 在实验过程中,有时会出现一批结果阳性率很高,一批结果阳性率又下降很多,如此反复,这种现象大都是由于采样时污染所致,一般来讲正规试剂生产厂家,其试剂出厂时都要经过严格的质量检测、批间,特别是批内差异都极小,不致出现如此明显的反复,这种现象主要是由于收集样本的试管或吸管受到污染所致。PCR扩增非常敏感,而一般实验室对重复使用的试管所进行的洗涤方法往注不能去除痕量DNA,这些痕量DNA便成为PCR模板,出现阳性扩增结果,由于采样试管受污染程度不一,所以出现忽高忽低的现象解决方法建议使用一次试管及吸咀取样。 二、 假阴性扩增: 如果连续几次扩增结果都是阴性,或已知阳性样本出现阴性扩增结果,一般认为这是假阴性,出现这现象有以下几种原因: ⒈ 仪器故障: 出现全阴结果,首先考虑到仪器运转是否正常。正确判断仪器的工作状况,是排除假阴性其它原因的基础,仪器运转是否正常是PCR扩增最关键的步聚之一。判断仪器是否正常,首先要测定加热体的温度是否准确,波动范围是否答合要求,各孔之间差异是否符合要求,PCR扩增往往对仪器加热温度及各管间的差异要求有很高的精度,如果误差太大,势必出现假阴性。必须注意的是不能过信名牌,我们经常发现一些名牌机器温度差异高达二度以上。 ⒉ 试剂失效或无效: 了解机器是否正常,便可对试剂进行检测。首先要了解试剂是否超过有效期,试存放方法是否达到要求,如果试剂盒在有效期内,贮存方法是正确,那么就应该仔细、慎重地判断试剂是否是无效试剂或称不合格试剂。可以用已知阳性样本,或试剂盒提供的阳性对照,严格按说明书操作扩增一次,然后把扩增产物用双蒸水稀释1000倍,作为模板进行第二次扩增,判断结果,如果是阴性说明试剂无效或不合格,如果结果阳性那么可用以下方法判定试剂的灵敏度。
什么是PCR技术? PCR(Polymerase Chain Reaction)技术,中文译为聚合酶链式反应,是一种在体外(试管、切片…)扩增核酸的技术。PCR的基本反应包括以DNA为模板的反应和以mRNA为模板的反应。 PCR技术是模拟体内天然DNA(脱氧核糖核酸)的复制过程。以扩增DNA为例,其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下,特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
【参数解读】基因扩增仪(PCR)的技术参数解读与使用PCR技术的基本原理PCR技术的基本原理 类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成:①模板DNA的变性:模板DNA经加热至93℃左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备;②模板DNA与引物的退火(复性):模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合;③引物的延伸:DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2~4分钟, 2~3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。请您来解析:1、普通PCR仪,梯度PCR仪,原位PCR仪,实时荧光定量PCR仪四类仪器有何异同?http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/02/201502251536_536341_1608710_3.png2、我们应该如何根据检测需求来选购PCR的四类仪器?根据检测的定量要求来选择仪器类型。3、PCR的核心参数都有哪些?核心参数是温度控制。4、梯度PCR仪可以分离不同DNA的片段吗?与普通PCR的异同在哪?梯度PCR可以分离不同DNA片段,与普通PCR仪不同的地方在于。可以设置一系列的梯度退火温度进行扩增,从而一次性PCR扩增就可以筛选出表达量高的最适合退火温度进行有效的扩增。主要用于研究未知DNA退火温度的扩增,这样可节省试验时间、提高实验效率,又节约实验成本。5、使用过程中常见的问题PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性,但令人头痛的问题是易污 染,极其微量的污染即可造成假阳性的产生. 一、污染原因 (一)标本间交叉污染:标本污染主要有收集标本的容器被污染,或标本放置时,由于 密封不严溢于容器外,或容器外粘有标本而造成相互间交叉污染;标本核酸模板在提 取过程中,由于吸样枪污染导致标本间污染;有些微生物标本尤其是病毒可随气溶胶 或形成气溶胶而扩散,导致彼此间的污染. (二)PCR试剂的污染:主要是由于在PCR试剂配制过程中,由于加样枪、容器、双蒸水 及其它溶液被PCR核酸模板污染. (三)PCR扩增产物污染.这是PCR反应中最主要最常见的污染问题.因为PCR产物拷贝量 大(一般为1013拷贝/ml),远远高于PCR检测数个拷贝的极限,所以极微量的PCR产物 污染,就可造成假阳就可形成假阳性. 还有一种容易忽视,最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染;在空气与液体面摩 擦时就可形成气溶胶,在操作时比较剧烈地摇动反应管,开盖时、吸样时及污染进样 枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染.据计算一个气溶胶颗粒可含48000拷贝,因而由 其造成的污染是一个值得特别重视的问题. (四)实验室中克隆质粒的污染:在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的 检验室,这个问题也比较常见.因为克隆质粒在单位容积内含量相当高,另外在纯化 过程中需用较多的用具及试剂,而且在活细胞内的质粒,由于活细胞的生长繁殖的简 便性及具有很强的生命力.其污染可能性也很大. 二、污染的监测 一个好的实验室,要时刻注意污染的监测,考虑有无污染是什么原因造成的污染,以 便采取措施,防止和消除污染. 对照试验 1.阳性对照:在建立PCR反应实验室及一般的检验单位都应设有PCR阳性对照,它是PCR 反应是否成功、产物条带位置及大小是否合乎理论要求的一个重要的参考标志.阳性 对照要选择扩增度中等、重复性好,经各种鉴定是该产物的标本,如以重组质粒为阳 性对照,其含量宜低不宜高(100个拷贝以下).但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳 性标本,其对检测或扩增样品污染的可能性很大.因而当某一PCR试剂经自己使用稳 定,检验人员心中有数时,在以后的实验中可免设阳性对照. 2.阴性对照:每次PCR实验务必做阴性对照.它包括①标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照.②试剂 对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA,进行PCR扩增,以监测试剂是否污染. 3.重复性试验 4.选择不同区域的引物进行PCR扩增 三、防止污染的方法 (一)合理分隔实验室:将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定 等步骤分区或分室进行,特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开. 最好能划分①标本处理区;②PCR反应液制备区;③PCR循环扩增区;④PCR产物鉴定区. 其实验用品及吸样枪应专用.实验前应将实验室用紫外线消毒以破坏残留的DNA或RNA. (二)吸样枪:吸样枪污染是一个值得注意的问题.由于操作时不慎将样品或模板核酸吸 入枪内或粘上枪头是一个严重的污染源,因而加样或吸取模板核酸时要十分小心,吸 样要慢,吸样时尽量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或产生气溶胶污染. (三)预混和分装PCR试剂:所有的PCR试剂都应小量分装,如有可能,PCR反应液应预先 配制好,然后小量分装,-20℃保存.以减少重复加样次数,避免污染机会.另外,PCR试剂,PCR反应液应与样品及PCR产物分开保存,不应放于同一冰盒或同一 冰箱. (四)防止操作人员污染,使用一次性手套、吸头、小离心管应一次性使用. (五)设立适当的阳性对照和阴性对照,阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准病 原体核酸为宜,并注意交叉污染的可能性,每次反应都应有一管不加模板的试剂对照 及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照. (六)减少PCR循环次数,只要PCR产物达到检测水平就适可而止. (七)选择质量好的Eppendorf管,以避免样本外溢及外来核酸的进入,打开离心管前 应先离心,将管壁及管盖上的液体甩至管底部.开管动作要轻,以防管内液体溅出. 常见问题分析与对策 PCR产物的电泳检测时间 一般为48h以内,有些最好于当日电泳检测,大于48h后带型不规则甚致消失。 假阴性,不出现扩增条带 PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备,②引物的质量与特异性,③酶的质量及, ④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。 模板:①模板中含有杂蛋白质,②模板中含有Taq酶抑制剂,③模板中蛋白质没有消 化除净,特别是染色体中的组蛋白,④在提取制备模板时丢失过多,或吸入酚。⑤模 板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时,不出现扩增带,极有可能是标本的消化处 理,模板核酸提取过程出了毛病,因而要配制有效而稳定的消化处理液,其程序亦应 固定不宜随意更改。 酶失活:需更换新酶,或新旧两种酶同时使用,以分析是否因酶的活性丧失或不够而 导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。 引物:引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称,是PCR失败或扩增条带不 理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题,两条引物一条浓度 高,一条浓度低,造成低效率的不对称扩增,对策为:①选定一个好的引物合成单 位。②引物的浓度不仅要看OD值,更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳,一定要有 引物条带出现,而且两引物带的亮度应大体一致,如一条引物有条带,一条引物无条 带,此时做PCR有可能失败,应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高,一条 亮度低,在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存,防止多次冻融 或长期放冰箱冷藏部分,导致引物变质降解失效。④引物设计不合理,如引物长度不 够,引物之间形成二聚体等。 Mg2+浓度:Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大,浓度过高可降低PCR扩增的特 异性,浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。 反应体积的改变:通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul,应用多 大体积进行PCR扩增,是根据科研和临床检测不同目的而设定,在做小体积如20ul 后,再做大体积时,一定要模索条件,否则容易失败。 物理原因:变性对PCR扩增来说相当重要,如变性温度低,变性时间短,极有可能出 现假阴性;退火温度过低,可致