高效感受态细胞

感受态细胞的制备(一)制备新鲜或冷冻的大肠杆菌感受态细胞　　下述操作方案是由Hanahan(1983)提供的，所制备的大肠杆菌DHl、DH5和ＭＭ249感受态细胞培养物能使每微克超螺旋ＤＮＡ以≥5x108转化菌落的频率进行转化，其他大多数大肠杆菌菌株的最高转化率大约只有前述菌株的1/10-1/5。尽管如此，实际上对所有克隆方面的用途来说，这已绰绰有余。一些大肠杆菌菌株（如ＭＣ1061）不适于此法。下列有３个因素对于获得持续高的转化频率来说是至关重要的：（１）转化缓冲液中试剂的纯度 务必使用所能得到的最高质量的试剂，这些试剂应分装成小份，避光保存于冷处。（２）细胞的生长状态 由于一些不清楚的原因，直接用贮存于-70┴冰冻培养基中的贮存原种搠种而进持培养的细菌，所得到的转化效率最高，不应使用在实验中的贮存原咱接种崦进持培养的细菌，所得到的转效率最高，不应使用在实验室中连续传代，贮存于４℃或贮存于室温的培养物。（３）玻璃和塑料器皿的清洁度 痕量的去污剂或其他化学物质的存在可能大大地降低细菌的论效率，所以最好拨出一批玻璃器皿专用于制备感受态细菌，而不作它用。这些玻璃器皿应用手洗刷，再灌满纯水（Ｍilli-Ｑ级或与其相当的级别），然后高压灭菌，临用前方把水倒掉。细心操作的话，几乎总是可以获得转化效率高的感受态细胞，每微克超螺旋ＤＮＡ可能得到5x107-1x108个转化菌落。然而甚至经验最为丰富的工作者也不可能保证持有必要用标准的螺旋质粒ＤＮＡ制品来检测每一批新的感受态细胞的转化效率。制备感受态细胞前，先制备一大批黧的螺旋质粒ＤＮＡ，分装成许多小份贮存于-70℃。这些标准制品可用来检验每一批新的感受态细胞的转化效率，并检查每一个实验的转化效率。设立这样一个阳性对照后，如果某一次实验得不到转化菌落，就可以根据对照的情况查明宣究竟是感受态细菌方面有庇漏，还是ＤＮＡ制品间有差异。分装的感受态细菌可在-70℃保存几个月而转效率无明显下降。１）用无菌铂丝直接蘸取冻存有大肠杆菌ＤＨl株（或ＤＨ５株、ＭＭ249株原种）（贮存于-70℃的冻培养基上，见附录Ａ），在SOB琼脂平板表面划线， 于37℃培养16小时。将冰冻的细菌融化，铂丝在冻存细菌原种的表面划过时，已带上足量的细菌，因此一管冻存细菌原种可使用多次。２）将４－５个分隔良好的菌落转移到１ml含20mmol/L MgSo４的SOB中，菌落直径为１－２mm。中速振荡使细菌分散，然后在1L锥瓶中用30-100ml含20mmol/LMgSO4的SOB稀释培养物。３）于37℃将细菌培养0.5-3.0小时，为达到高效转化，活细胞数务必少于108细胞/ml，可每隔20-30分钟测定ＯＤ600值来检测培养物的生长情况。在菌株与菌株之间，ＯＤ600值和每毫升中活细胞数间的关系变化很大，因此有必要通过测量特定大肠杆菌菌株的生长培养物在生长周期的不同时相的ＯＤ600值，并将各稀释度的培养物铺于无抗生素的ＬＢ琼脂平皿以计算每时相的活细胞数，从而使分光光度读数得到标化。４）在无菌条件下将细菌转移到一个无菌、一次性使用的、用冰预冷的50ml聚丙烯管（Falcon 2070）中，在冰上放置10分钟，使培养物冷却至０℃。切记：下述所有步骤均需无菌操作。５）于４℃用Sorvall GS3转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟， 回收细胞。６）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。７）用约20ml（每个50ml管）用冰预冷的转化缓冲液（对于TFB''见表1.3；对于FSB，可参见表1，4）轻轻振荡，重悬沉淀（若制备需立即使用的感受态细胞可用TFB:若制备需要贮存于－70℃的感受态细胞则用FSB），将重悬细胞冰浴10分钟。８）于４℃用Sorvall GS3转头或与其相当的转头）以4000转．分离心10分钟，回收细胞。９）倒出培养液，将管倒置１分钟以使最后残留的痕量培养液流尽。10）用４ml（每个50ml管）用冰预冷的ＴＦＢ或ＦＳＢ轻轻振荡重悬沉淀。按步骤11）a给出的操作程序制备立即使用的感受态细胞，而步骤11）b制德贮存于-70℃留待以后使用的感受态细胞。11）a.新鲜感受态细胞的制备a）将140μl DnD溶液加到每一悬液的中心，立即轻轻旋转以混匀悬液，然后在冰上放置15分钟。DnD溶液二硫苏糖醇（DTT) 1.53gDMSO 9.0ML1mol/L乙酸钾（pH78.5) 100μl水至 10MLDnD溶液作可耐受人机溶剂的Millex SR膜（Millipore）过滤除菌，将DnD溶液分装成160μl小份放入0.5ml的无菌微量离心管中，密封管口，贮存于-20℃。DMSO的氧化产物，据推测可能是二甲硫醚，是转化的掏物。为避免这个问题，应购买质量最好的DMSO。应将所购试剂分装成10ml小份，放入无菌试管，密封管口，贮存于-70℃。每小份只用１次，用后弃去。１mol/L乙酸钾（pH7.5）的配法。b）每管再加140μlDnD溶液，轻轻旋转混匀之，将悬液置于冰上，再放15分钟。c）将小份悬液分装到冷却的无菌聚丙烯管（Falcon 2059''17x100mm）中，将管置于冰上。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些．加入ＤＮＡ后，于42℃短暂加热感受态细胞，这是一个关键步骤，务必以正确的升温速度使细胞加温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059型管获得的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。b.冻存的感受态细胞的制备a）每４ml重悬细胞加140 μl DMSO，轻轻旋转混匀之，将悬液置冰上15分钟。b）每份悬液再加140μl DMSO，轻轻旋转混匀之，重新放入冰浴中。c）迅速将悬液分装到冷却的无菌的微时离心管中，封紧管口，没入液氮中快速冰冻感受态细胞。贮存于-70℃备用。就大多数克隆方面的用途来说，50μl感受态细胞悬液已绰绰有余。然而，如需要更大量的转化菌落（如构建cDNA文库），每小份感受态细胞的量可能需要加大些。d）需要时，从-70℃冰箱中取出一管感受态细胞，把管握于手民主，融化细胞。细胞一经融化，立即把管转移至冰浴中，在冰上放置10分钟。e）用一冷却的无菌吸头把感受态细胞转移到冷却的无菌聚丙烯管中（Falcon2059''17x100mm）中，放置在冰浴上。加入ＤＮＡ后，于42℃短暂加热感受态细胞，这是一个关链步骤，务必以正确的升温速度使细胞如温到正确的温度。下面给出的所有时间和温度是用Falcon 2059试管获者的数据，其他类型的管未必可产生相同的结果。12）将ＤＮＡ加入到感受态细胞中，轻轻旋转几认混匀内容物。在冰上放置30分钟。为得到最佳结果，ＤＮＡ溶液的体积不应超过感受态细胞体积的５％。转化体的数量相对于所加入的ＤＮＡ量近妣例地增加，直至系统达到饱和，尽管感受态细胞在不同批次之间有一些差异，50μl感受态细胞通常可被约lng超粒ＤＮＡ所饱和。虽然再加ＤＮＡ也不影响转化体的总产量，但使用过多的ＤＮＡ将降低系统的效率（以每微克ＤＮＡ所获转化体的数量来衡量）。当所转化的ＤＮＡ很难得时（如用从相对难得的样品中提取mRNA而合成的cDNA），这就显得格外重要。为最大限度地提高转化菌落的数目，可把现有ＤＮＡ分置于几小份感受态细胞中，以期系统不致饱和。试验中一定包括下面的对照：a.加入已知量的标准超螺旋质粒ＤＮＡ制品的感受态细胞。b.完全不加质粒ＤＮＡ的感受态细菌。13）将管放入预加温到42℃的循环水浴中放好的试管加架上，恰恰放置90秒，不要摇动试管。14）快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却１－２分钟。15）每管加800μl ＳＯＣ培养基（见附录Ａ）。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到37℃摇床上，温育43分钏使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。为最大限度地提高转化效率，复苏期中应温放地摇动细胞（转速225转/分）。16）将适当体积（每个90m平板达200μl）已转化的感受态细胞转移到含20mmol/L MgSO4和相应抗生素的ＳＯＢ琼脂培养基上。如培养物体积太小（〈10μl），可再加肉汤培养基，用一无菌的弯头玻棒轻轻地将转化的细胞涂到琼脂平表面。如在一个90mm平板上铺200μl以上的感受态细胞，应离心浓缩细胞（于室温用Sorvall SS34转头（或与其相当的转头）以4000转/分离心10分钟），然后用适量SOC轻轻重悬细胞。如用四环素抗性作为选择标记，全部的转化混合物可以铺在一个单独的平皿上（或铺在软琼脂中）。然而如选用氨苄青霉素抗性，则只能将一部分培养物（根据实验决定）铺在单独的平皿上，氨苄青霉素抗性菌落数的曾加与平皿上所加细菌数的增加并无线性比例关系，这可能是因为被抗生素杀死的细胞可释放生长抑制物质的缘故。\par 17）将平板置于室温直至液体被吸收。18）倒置平皿，于37℃培养，12-16小时后可出现菌落。如检查氨苄青霉素抗性，用转化细胞铺平板时密度应较低（每个90mm平板不超过104菌落），于37℃培养平板时不应超过20小时。氨苄青霉素抗性的转化体可将β－内酰胺酶分泌到培养基中，迅速灭活菌落周围区域中的抗生素。这样，铺平板时懊度太高或培养时间太长都会导致出现对氨苄青霉敏感的卫星菌落。在造

[size=10px][font=&]大肠杆菌宿主菌株作为受体细胞，当这些受体细胞经过([/font][font=&]CaCl[/font][font=&][sub]2[/sub][/font][font=&])处理时，它们的细胞膜通透性会发生暂时性的改变，从而成为能够允许外源[/font][font=&]DNA[/font][font=&]分子进入的感受态细胞。[/font] [b]一、感受态细胞 [font=&]1.感受态：[/font][/b][font=&]受体细胞最容易接受外源基因并将其转化的一种[b]生理状态[/b]。[/font][b][font=&]2.感受态细胞：[/font][/b][font=&]受体细胞通过理化方法处理，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态的细胞。[/font][b][font=&]3.感受态菌龄：[/font][/b][font=&][/font][font=&]细胞的感受态一般出现在[b]对数生长期[/b]，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态和实现成功转化的关键。[/font] [b][font=&]4.质粒转化：[/font][/b][font=&]质粒DNA或以他为载体构建的重组子导入细菌的过程。[/font] [/size] [b][size=10px]二、感受态细胞制备的原理[/size][/b] [size=10px][b][font=&]1.外源基因表达的条件：[/font][/b][font=&]重组[/font][font=&]质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因。[/font][b][font=&]2.感受态制备原理：[/font][/b]将快速生长的大肠杆菌置于经低温0℃预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（渗透作用），同时，[font=&]Ca[/font][sup]2+[/sup]会使细胞膜磷脂双分子层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，离开所在区域，诱导细胞成为感受态细胞。[b][font=&]3.质粒转化原理：[/font][/b]感受态细胞细胞膜通透性发生变化，极易与外源DNA相粘附并在细胞表面形成抗脱氧核糖核酸酶的羟基-磷酸钙复合物。将该体系转移到42℃下做短暂的热刺激90s，细胞膜的液晶结构会发生剧烈扰动，并随机出现许多间隙，外源DNA就可能被细胞吸收。 [b]4.外源基因表达：[/b]进入细胞的外源DNA分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将转化后的细胞在选择性培养基上（相应抗生素抗性）培养，筛选出带有外源DNA分子的阳性克隆。 [b]三、感受态细胞的制备（[font=&]CaCl[/font][font=&][sub]2[/sub][/font]法） [font=&]1. 受体菌种活化：[/font][/b][font=&]取[/font][font=&]-80℃[/font][font=&]冰箱中保藏的菌株（如[/font][font=&]DH5α[/font][font=宋体]、[/font][font=&]Top10、DE3、BL21等）[/font][font=&]在[/font][font=&]LB[/font][font=&]平板（无抗性）上划线分离，放置于[/font][font=&]37℃[/font][font=&]恒温培养箱中倒置培养。[/font][b][font=&]2. 受体菌培养：[/font][/b][font=&]从[/font][font=&]LB[/font][font=&]平板上挑取单菌落，接种于10mLLB液体培养基中，[/font][font=&]37℃[/font][font=&]震荡培养12h左右至对数生长中后期。[/font][b][font=&]3. 菌种的准备：[/font][/b][font=&]将受体菌菌悬液以2%的接种量接种于装有20mLLB液体培养基（无抗性）中，37℃震荡培养大约2-3h至OD600=0.4-0.5，菌落数[/font][font=&]＜[/font][font=&]10[/font][font=&][sup]8[/sup][/font][font=&]cfu/mL[/font][font=&]。[/font][/size][align=center][size=10px] [/size][/align][size=10px][font=&][/font][b][font=&]4. 感受态细胞的制备：[/font][/b][font=&][/font][b][font=&](1)离心：[/font][/b][font=&]把上述菌液转移至1.5mL离心管中，冰浴10min，在4℃，3000r/min，离心10min。[/font][b][font=&](2)重悬冰浴：[/font][/b][font=&]弃上清液，加入10mL预冷的0.05M 的CaCl[sub]2[/sub]溶液，轻轻混匀，冰浴30min后，在4℃，3000r/min，离心10min。[/font][b][font=&](3)重悬：[/font][/b][font=&]弃上清，加入6mL预冷的含15%甘油的0.05MCaCl[sub]2[/sub]溶液，轻轻混匀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液。或弃上清，加入6mL预冷0.05MCaCl[sub]2[/sub]溶液，轻轻混匀，冰上放置几分钟，即成感受态细胞悬液，直接使用。[/font][b][font=&](4)分装：[/font][/b][font=&]用[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/9p][color=#3333ff]移液枪[/color][/url]分装重悬液至1.5mL离心管中，每个离心管中分装50μL悬浮液。[/font][b][font=&](5)保藏：[/font][/b][font=&]标记贴标签[/font][font=&]，使之迅速冷冻，-80℃保藏备用。 [/font][b]五、质粒化学转化[font=&]1.取感受态：[/font][/b][font=&]如果感受态细胞保藏于-80℃，从-80℃冰箱中取一支感受态，室温下解冻后立即冰浴；如果感受态细胞没有保藏，可以直接用于转化。[/font][b][font=&]2.质粒处理：[/font][/b][font=&]一般质粒为粉末，1ng质粒添加10μL缓冲液或蒸馏水，混匀。[/font][b][font=&]3.转化：[/font][/b][font=&][/font][font=&]在含有50μL感受态细胞的离心管中加入1μL稀释后的标准质粒充分混匀，冰上静置30min。[/font][b][font=&]4.热击：[/font][/b][font=&]将离心管置于42℃热击60-90s，然后迅速冰浴，使细胞冷却2-3 min。[/font][b][font=&]5.培养：[/font][/b][font=&]向离心管中加入已预热的无菌LB培养基（无抗性）300μL，150rpm、37℃恒温震荡培养45min。[/font][b][font=&]6.涂布：[/font][/b][font=&]吸取100μL菌液于LB固体培养基上（含抗性），用涂布器均匀涂布，放置于[/font][font=&]37℃恒温培养箱中倒置培养12-16h。 [/font][b][font=&]7.转化率计算：[/font][/b][font=&][/font] [font=&]转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中菌落数可计算出转化子总数和转化效率，公式如下：[/font] [font=Times New Roman, serif]转化总数=菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积/涂板菌液体积[/font] [font=Times New Roman, serif]转化率=转化子总数/质粒[/font][font=&]DNA[/font][font=Times New Roman, serif]加入量[/font][font=&]μg[/font] [font=&]理论上转化率最高为每微克的标准质粒转化的菌落数为1×10[/font][sup]10 [/sup][font=&]。[/font] [b]六、注意事项 [font=&]1. 严格无菌操作[/font][/b][font=&][/font] [font=&]操作过程，注意进行无菌操作，避免环境中杂菌污染。[/font] [b][font=&]2.严格控制温度[/font][/b][font=&][/font] [font=&] 操作过程，要注意操作温度，以保持细胞的状态；[/font] [font=&]加入抗生素时注意温度，避免过高温度导致抗生素失活。[/font] [b][font=&]3. 严格控制浓度[/font][/b][font=&][/font] [font=&]严格控制细胞的生长阶段和菌浓，严格控制质粒DNA的质量和浓度，以提高转化效率。 [/font] [font=&][/font] [b][font=&]4. 计算转化率[/font][/b][font=&][/font] [font=&]记录和计算转化率的指标如转化子总数、感受态细胞总数和转化频率以评估转化效率。[/font][/size]

酵母感受态的制备:1. 取500-1000微升的酵母感受态菌株，加入到3到5毫升的新YPDA培养基中，30度震荡5-8小时，250rpm2. 取5微升摇好的感受态菌液加到25-50毫升的新YPDA培养基中，30度震荡培养15-20小时，浓度0.15-0.3（视情况想快点可多取点少摇一会）3. 离心700g，5分钟室温下，倒掉上清加入25-100毫升的新YPDA培养基，把菌体摇起来摇匀，30度震荡培养3-5小时4. 离心700g，5分钟室温下，倒掉上清，无菌水重悬（5-10毫升）5. 离心700g，5分钟室温下，倒掉上清，1.5毫升（1倍TE和LiAc的混合液）重悬，并转移到2毫升的离心管中6. 高速离心15秒（12000就可以）去上清加入50微升乘以感受态管数的量（1倍TE和LiAc的混合液）重悬并分装。感受态已制成7. 吸取50微升感受态到1.5或2.0的离心管中，加入5到15微升的质粒100ng（及5微升的carrier DNA有了加没有可以不加）8. 加入500微升的PEG/LiAc（1倍TE和LiAc、 PEG 40%的混合液）轻轻混匀9. 30培养30min，10分钟震荡一次10. 加入20微升的DMSO混匀11. 42度热激15min，每5min混匀一次12. 高速离心15秒，去掉上清加入500-800微升的YPDA或YPD plus重悬，30度培养，（转化时是可选步骤，筛库转化时需要培养90min）13. 离心去上清，以0.9%的生理盐水重悬。（可选步骤）14. 吸取100微升涂板，pGBKT→SD/-Trp→Y2H pGADT→SD/-Leu→Y187