高通量靶向代谢组学

mGWAS (metabolome Genome-Wide Association Study)指基于代谢组学的全基因组关联分析，是将代谢组数据作为表型，与基因型数据进行关联分析的一种领先方法。由于代谢组数据对表型鉴定更为精细，因此关联分析的精度比传统GWAS分析更高。 海南大学和华中农业大学的罗杰教授团队在mGWAS领域建树颇丰，近年来已有10余篇相关研究发表在高分杂志上。 2020年12月7日，《Nature Plants》杂志在线发表了罗杰教授团队的最新文章《Selection of a subspecies-specific diterpene gene cluster implicated in rice disease resistance》，该篇研究针对水稻中双萜化合物的合成通路相关基因簇进行了深度解析。双萜类化合物是水稻中植物抗菌素的主要种类之一，本研究在7号染色体（DGC7）上发现了完整编码5,10-双酮蓖麻烯（单环蓖麻烯衍生物的成员）整个生物合成途径的一个基因簇。 文章采用领先的代谢组检测技术——广泛靶向代谢组检测技术，实现高通量、高灵敏、广覆盖、无差异的检测近1000种代谢物，助力代谢组学和多组学研究。水稻中双萜基因簇的鉴定 本研究使用超高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪LCMS-8060，对采用相应候选物侵染或未侵染的本氏烟草叶片进行代谢谱分析，10-酮蓖麻烯和5,10-双酮蓖麻烯对照品从水稻叶中纯化得到。 5,10-双酮蓖麻烯的质谱图 图a为本氏烟草叶中同时过表达OsTPS28，OsCYP71Z2和OsCYP71Z21的产物图b为5,10-双酮蓖麻烯标准品本文中使用的串联质谱仪LCMS-8060和GCMS-TQ8040（拍摄于华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室）

靶向代谢组学中，通常需要同时检测多个目标组分，这对质谱数据的采集速度提出了很高的要求。 岛津超快速质谱（UFMS）拥有业内首屈一指采集速度。以LCMS-8050为例，其驻留时间（Dwell time≥0.8 ms）、切换时间（Pause time≥1 ms）、扫描速度（Scan speed≤30000 u/sec）、正负极切换速度（Polarity switching time=5 ms）；并且具有触发子离子扫描功能，可以实现MRM定量的同时对目标组分进行子离子扫描定性分析。 以下图为例，假设一个峰宽6秒的UHPLC色谱峰用于定量分析，必须有20个采集点左右，峰型才足够平滑，峰面积和出峰时间的重复性才能达标。如此算来，每个采集点的循环时间（loop time）只有300 ms。在300ms的时间段内，需要进行所有目标组分的采集，如下AB正离子，CD负离子： 1.采集循环开始，切换时间内对质谱通道电压进行调整（为A离子对“铺路”）；2.A母离子通过四级杆Q1、碰撞池内进行碰撞、四级杆Q3筛选子离子、最终到达检测器进行离子计数，这段时间总和即为驻留时间；3.为B离子重复以上过程，到此正离子采集完成；4.接着切换从离子源到质谱通道到检测器的电压为负，此为正负极切换时间；5.进入到C、D的采集过程，过程与AB一样；6.最后将电压切换为正，到此结束整个循环时间，开始下个采集点的循环时间。 这只是两个正离子和两个负离子的采集例子，如果采集目标组分数量急剧增加，在峰宽不变的情况下（即循环时间loop time不变），分到每个离子的驻留时间和切换时间将急剧减少，因此最小驻留时间和切换时间，直接决定了该质谱在所能同时采集的离子对数量，这对于靶向代谢组学或其他需要进行多目标物同时筛查的项目，至关重要！ 图2. 质谱采集信号的过程，以及频率和点数的关系最后，举例说明岛津UFMS在靶向代谢组学中的一个应用实例：脂质组学属于代谢组学的一个分支。为进行靶向脂质组学研究，岛津公司利用超快速质谱适于多化合物同时检测的特性，推出了第三版脂质介质方法包：包含了主要脂类化合物如类花生酸、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）等多价不饱和脂肪酸代谢物，花生四烯酸乙醇胺（AEA）、血小板活化因子（PAF）等196种主要脂质介质及其相关物质的色谱、质谱条件（MRM通道）。 该方法只需20分钟的色谱分析便能获得这196种化合物的脂质介质的分析结果。此外，方法包中还根据出峰时间和结构特性，准备了18种氘代内标化合物的MRM通道。另外，该方法包可进行保留时间校正，可使用内标法进行半定量，所以可用于检索多变量解析时的标记物。下图显示了超快速质谱MRM模式中，196种脂质和18种内标同时分离所采集得到的色谱图。 图3. 脂质介质方法包用于196种脂质，18种内标的分离 撰稿人：钟启升

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " strong 仪器信息网讯 /strong 中国科学院大连化物所高分辨分离分析及代谢组学研究组（1808组）许国旺研究员团队对前期提出并发展的拟靶向代谢组学方法进行了系统总结和提升，相关结果形成范本并于2020年6月发表在《自然-实验手册》（Nature Protocols）。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width: 100% max-height: 100% width: 600px height: 258px " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202007/uepic/f9773d5c-4201-4900-b788-53a11c4c183f.jpg" title=" 微信截图_20200723151706.png" alt=" 微信截图_20200723151706.png" width=" 600" height=" 258" border=" 0" vspace=" 0" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 代谢组学是研究内源性代谢物的科学，超高效液相色谱-质谱是广泛使用的分析工具。代谢组学分析策略主要有 strong 非靶向和靶向两种 /strong ， strong 前者一般使用高分辨质谱获得丰富的代谢物信息 /strong ，但存在数据复杂、重复性差、线性范围窄等缺点；而 strong 后者一般使用三重四极杆质谱 /strong ，数据质量有了很大提高，但通常只检测已知代谢物，覆盖度低。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 针对上述特点， strong 许国旺研究团队于2012年首次提出拟靶向代谢组学的概念 /strong (J Chromatogr A.，2012，1255：228-36)。其创新之处在于， span style=" text-indent: 2em color: rgb(0, 112, 192) " strong 提出了一种定量离子选择算法，用于对所有检测到的代谢物进行定量离子选择，通过保留时间锁定气相色谱-质谱选择离子监测方式，样品中已知和未知的代谢物均可被测量，该方法兼具非靶向和靶向代谢组学的优点。 /strong /span 在2013年，该方法被延伸到液相色谱-质谱（Anal Chem.，2013，85：8326-33），在方法建立时用高分辨质谱获取代谢物的离子对信息，而在实际样品分析时采用靶向的多反应检测（MRM）方式测量代谢物的丰度，该方法覆盖度高、线性和重复性良好，而且不需要标样来限定检测的代谢物。　　 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 在随后的工作中，为提高方法建立的效率，该团队进一步开发了自动挑选离子对的软件(Anal Chem.，2015，87：5050-5)，并建立了针对大规模临床样本分析的数据校正方法，对超千个样品的分析也获得了较好的重复性(Anal Chem.，2016，88：2234-42；J Chromatogr A.，2016，1437：127-136)。在此基础上，为提高方法中包含的离子对个数，提高覆盖度，该团队发展了基于SWATH技术的拟靶向代谢组学方法，在正离子下就可在血浆中获得1373个离子对(Anal Chem.，2018，90：11401-11408)。在研究脂质结构-质谱特征规律、色谱保留规律的基础上，该团队建立了高覆盖度拟靶向脂质组学分析新方法，涵盖19个脂类、3377个脂质离子对，覆盖7000多种脂质分子结构(Anal Chem.，2018，90：7608-7616)。在最近的工作中，为进一步提高覆盖度，该团队在高峰容量的二维液相色谱-质谱系统上建立了拟靶向方法(Anal. Chem.，2020，92：6043-6050)，正离子模式和负离子模式分别检测到1294和687个离子对，建立的二维液相色谱-质谱拟靶向代谢组学方法可用于分离分析氨基酸、胆汁酸、肉碱、溶血磷脂、鞘脂、磷脂和甘油三酯等。这些方法已在恶性肿瘤（肝癌、肺癌）和糖尿病等代谢性疾病的研究中发挥积极作用，近20余项相关结果在Hepatology, Anal. Chem., J. Proteome Res.等国际权威期刊发表，并被其他实验室采用。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 目前，高覆盖度的（半）定量代谢组学方法在生命科学各领域均受到重视，拟靶向方法将会起到越来越重要的作用。为了让更多的同行使用拟靶向方法，基于上述前期工作，以血清/血浆为例，该研究团队进一步优化了拟靶向代谢组学建立流程，升级并提供了开放式软件和工具，形成了方法范本。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 附件为2020年6月发表于《自然-实验手册》的文章：《 /span Development of a plasma pseudotargeted metabolomics method based on ultra-high-performance liquid chromatography–mass spectrometry》 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " img src=" /admincms/ueditor1/dialogs/attachment/fileTypeImages/icon_pdf.gif" style=" vertical-align: middle margin-right: 2px " / a href=" https://img1.17img.cn/17img/files/202007/attachment/c1122057-ab40-4e94-881c-6a015edd762b.pdf" title=" 10.1038@s41596-020-0341-52020-06.pdf" style=" font-size: 12px color: rgb(0, 102, 204) " 10.1038@s41596-020-0341-52020-06.pdf /a /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span br/ /p