二者相互作用

北京大学的研究人员报告称，他们开发出了一种遗传编码蛋白质光交联剂，其带有可转移的、质谱可识别的标签。这一研究成果发布在7月27日的《自然通讯》(Nature Communications)杂志上。　　北京大学化学与分子工程学院的陈鹏(Peng R. Chen)研究员与王初(Chu Wang)研究员是这篇论文的共同通讯作者。　　蛋白质以其自身结构和与其他蛋白质之间的相互作用为基础发挥功能，因此，研究蛋白质的结构和相互作用抑制是生命科学的重要方向。　　检测蛋白质相互作用的传统方法，如酵母双杂交、亲和色谱和免疫共沉淀等有着各自的局限性。酵母双杂交可以揭示蛋白质间的直接相互作用，甚至通过大规模筛查发现未知的相互作用，但酵母细胞未必能为异源表达的其他物种蛋白提供合适的相互作用条件。亲和色谱技术和免疫共沉淀技术其通量比较低，背景结合蛋白质与特异性结合蛋白质有时难以区分，直接与间接相互作用也通常难以区分。另外，这三种方法对于瞬间、微弱的相互作用，比如信号转导过程中松散变化的蛋白质复合物，都很难获得有效信息。　　近年来，科学家们一直在不断地发展发现及描绘生理条件下蛋白质相互作用特征的技术，其中化学与光亲和交联策略获得越来越多的关注。将生物分子间的非共价相互作用转变为共价交联，使得能够捕获到时常出现在自然界中微弱且短暂的蛋白质相互作用。光交联剂结合质谱技术是近年发展起来在活体系统中研究蛋白质相互作用的一种有力的工具，但它仍然存在着高假阳性鉴别率及无法提供相互作用界面信息等缺点。　　在这篇文章中研究人员报告称，他们开发出了一种遗传编码光亲和非自然氨基酸，可在光交联及猎物蛋白-诱饵蛋白分离后将一个质谱可识别的标签(MS-label)导入到捕获的猎物蛋白中。这一叫做IMAPP的策略使得能够直接鉴别出采用传统的遗传编码光交联剂难以揭示的光捕获底物肽。利用这一MS-label，IMAPP策略显著提高了鉴别蛋白质相互作用的可信度，使得能够同时鉴别捕获的肽和确切的交联位点，对于揭示靶蛋白及绘制活体系统中蛋白质相互作用界面具有极高的价值。　　来自多伦多大学Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute (LTRI)和Donnelly中心的一组研究人员，开发出一种新技术，可以将细胞内的DNA条形码拼接在一起，以同时搜寻数百万个蛋白质配对，用以分析蛋白质相互作用。相关研究结果发表在2016年4月22日的《Molecular Systems Biology》杂志上(研究蛋白质相互作用的新技术)。　　斯克里普斯研究所(TSRI)的科学家们开发出了一种强大的新方法来寻找结合特定蛋白质的候选药物。发表在2016年6月Nature杂志上的这种新方法是一个重大的进展，它可以同时应用于大量的蛋白质，甚至直接应用于自然细胞环境中成千上万不同的蛋白质。一些小分子可以用来确定它们靶蛋白的功能，并可充当药物开发的起始复合物。TSRI的研究人员证实这一技术为许多过去认为无法很好结合这些小分子的蛋白质找到了“配体”(结合伴侣蛋白)(Nature发布突破性蛋白质新技术)。　　蛋白质是自然界的机器。它们供给氧气为我们的肌肉提供动力，催化一些帮助我们从食物中提取能量的反应，抵御细菌和病毒的感染。数十年来，科学家们一直在寻找方法设计可以满足某些医学、研究和工业特定用途的新蛋白质。现在，北卡罗来纳大学医学院的研究人员开发出了一种方法，通过将已存在蛋白质的片段拼接在一起来生成新蛋白质。这一叫做SEWING的技术发表在2016年5月的Science杂志上(Science发布突破性蛋白质技术)。

蛋白质与DNA的相互作用在生物学过程中具有关键作用。精确解析蛋白质-DNA相互作用能够揭示二者相互识别机制和动态变化，对于剖析生理和病理条件下基因的调控机制至关重要。虽然已有的研究方法在表征高亲和力的DNA-蛋白质（尤其是转录因子）的识别和作用机制方面取得了进展，但对于生物体系中低丰度的蛋白质以及动态、微弱的蛋白质-DNA复合物的分析仍颇具挑战性。　　为了实现时空动态的蛋白质-DNA相互作用全景解析，中国科学院上海药物研究所陈小华课题组和谭敏佳课题组合作，在前期开发的光诱导PANAC光点击化学的基础上，发展了具有赖氨酸选择性的蛋白质-DNA交联方法【Light-Induced Lysine (K) Enabled Crosslinking，简称LIKE-XL】，并结合该团队在深度定量蛋白质组学分析方面的丰富经验和技术优势，实现了对蛋白质-DNA动态互作包括弱相互作用的转录因子-DNA的时空动态性深度解析（如图）。4月27日，相关研究成果以Spatiotemporal and global profiling of DNA–protein interactions enables discovery of low-affinity transcription factors为题，发表在《自然-化学》（Nature Chemistry）上。　　科研人员设计合成了含光交联基团的DNA探针。该探针能够在低浓度（微摩尔浓度）、短时间（5-10分钟）高效交联相互作用的蛋白质。结合基于质谱的定量蛋白质组学技术，LIKE-XL全局性解析方法在鉴定相互作用蛋白质数目上远超基于非共价作用的技术；比非特异性的交联方法显示更优的效率和更高的灵敏度。LIKE-XL策略鉴定到预期低亲和力的转录因子-DNA相互作用，并发现目标DNA序列上新型转录因子及结合位点。进一步，通过整合交联位点、结构生物学信息和分子对接，研究发现了弱结合能力的转录因子与DNA结合的新作用模式。借助LIKE-XL技术，合作团队全局性揭示了表观遗传药物（如去乙酰化酶抑制剂SAHA）时间分辨的下游转录因子互作网络动态全景。　　该研究为全局性深度解析蛋白质-DNA的时空动态互作提供了新方法。以目标DNA序列为探针的互作蛋白质结合活性分析策略，有望用于解析目标DNA序列中不同的碱基修饰与蛋白质相互作用的研究，为DNA及表观遗传相关研究提供化学生物学新工具。　　　　　　研究工作得到国家自然科学基金重大研究计划“生物大分子动态修饰与化学干预”、国家自然科学基金创新研究群体项目“抗肿瘤新药敏感群体和耐药机制研究”、国家重点研发计划、上海市“科技创新行动计划”优秀学术/科技带头人计划项目等的资助，并获得上海交通大学医学院和复旦大学上海医学院等的科研人员的帮助。　　论文链接LIKE-XL方法全局性解析蛋白质-DNA时空动态相互作用示意图

生物分子的活性功能是通过分子之间的相互作用来实现的，研究生物分子间的相互作用，可以从分子水平上了解生命现象，从而阐明生命活动的机理，发现生命的本质。大分子相互作用仪作为研究分子间相互作用的重要研究工具，在生命科学、临床医学、环境检测和药物筛选等研究中发挥了巨大作用。近年来，研究分子间相互作用的技术层出不穷，然而每一种技术都存在应用价值和局限性。小编将主流的技术流派进行汇总，以飨读者。非标记技术在分子间相互作用研究中扮演着越来越多的角色。顾名思义，非标记技术不需要通过标记荧光基团、抗体、探针等外在分子，而是通过检测物理性质（如质量、折光率、频率、分子尺寸、能量等）在分子间相互作用过程中的变化来定性定量地研究分子间相互作用。因此，非标记技术能够有效避免了荧光干扰、特异性等问题，被广泛应用于蛋白质、核酸、多肽以及小分子化合物等生物分子间相互作用的研究。目前，主流的非标记技术主要包括表面等离子共振技术和生物膜干涉技术。表面等离子共振技术提到非标记分子间相互作用检测技术，熟悉的人们首先会联想到SPR技术即表面等离子共振(Surface Plasmon Resonance, SPR)技术。它是一种光学物理传感技术，其工作原理为当一束P偏振光以一定的角度范围内入射到棱镜端面，棱镜与金属薄膜（Au或Ag）的界面将产生表面等离子波。当入射光波的传播常数与表面等离子波的传播常数相匹配时，引起金属膜内自由电子产生共振，即表面等离子体共振。首先在芯片表面固定一层生物分子识别膜，然后将待测样品流过芯片表面，若样品中有能够与芯片表面的生物分子识别膜相互作用的分子，会引起金膜表面折射率变化，最终导致SPR角变化，通过设备监测SPR的角度变化，获得被分析物的浓度、亲和力、动力学常数和特异性等重要参数。SPR技术具有免标记、实时检测、所需样本量少、无需对样本进行复杂处理等优势，已广泛用来研究蛋白质、核酸、多肽、小分子化合物等生物分子的相互作用。1990年，瑞典Pharmacia公司与乌普萨拉大学的研究人员共同发明了全球第一台基于SPR技术的Biacore仪器，使人类第一次利用仪器就能对不同分子间的相互作用进行自动化检测。1996年，Biacore从Pharmacia公司剥离并独立运营，并于2006年被GE收购，成为GE医疗生命科学大家庭中的一员。2020年，丹纳赫集团正式完成对GE生命科学的收购，并更名为Cytiva（思拓凡）。自1990年至今，Biacore经历了30多年的发展，已成为分子互作的“金标准”和基础科研及药物开发的工具，先后推出了一系列的产品型号，从最初的Biacore 1000，到Biacore T系列，X系列以及最新的8K系列等。Biacore 8K/8K+生物分子互相作用分析系统 （点击查看）近年来，国内基于SPR技术研发的大分子相互作用仪在研发和商业化方面也取得了突破性进展，比如北京英柏生物科技有限公司利用SPR原理自主研发的MI-S200仪器，凭借其优异的性能和技术参数荣获2019年度中国分析测试协会科学技术奖BCEIA金奖。Inter-Bio 英柏表面 等离子共振检测仪MI-S200 （点击查看） 2019年，华中科技大学刘钢教授团队自主研发出一种新型纳米等离子光学传感器芯片，该芯片不需要光学耦合器件配合激发且具有更高的共振模式品质，借助这种传感器芯片后仅用常规的普通设备如光学显微镜和酶标仪等就能完成病毒表面蛋白和抗体之间结合过程的定量分析测定。生物膜干涉技术生物膜干涉（Bio-Layer Interferometry, BLI）又称生物层干涉，是一种通过检测干涉光谱的位移变化来检测传感器表面反应的技术。其工作原理为当一束可见光从光谱仪射出后，在传感器末端的光学膜层的两个界面会形成两束反射光谱，并形成一束干涉光谱。任何由分子结合或解离而形成的膜层厚度和密度变化，均能够通过干涉光谱的位移值而体现，并通过这个位移值做出实时的反应监测图谱。检测图谱示意图（图源赛多利斯官网）通过对分子结合过程的实时监测，系统会测定结合常数（ka）和解离常数（kd）以及起始结合速率，并通过拟合计算分析得到亲和力（KD）等重要数据。BLI技术具有实时分析、免标记、更高通量等优势，被广泛应用于蛋白结构靶点分析、药物研发与筛选及天然产物分析等生命科学研究领域。2020年底，BLI技术被正式收录于《美国2021版药典》1108章，这也表明BLI技术将作为药物检测标准规范，延展至更多的应用场景，推动科研和医疗健康行业的进步。ForteBio率先将BLI技术商业化， Octet分子互作分析系统凭借其高通量和简单易用的优点迅速获得了广大药物研发企业和科研工作者的青睐。后来，几经收购，目前Octet系列产品归属于赛多利斯公司，其最新产品Octet R系列，可提供2、4或8通道模式，满足不同科研需求，另外也可以升级成16或96通道，适用于工业应用。Octet R2分子互作分析系统 （点击查看） 随着科学技术发展，基于上述两种技术原理又衍生出一系列新技术，比如光栅耦合干涉技术、局域表面等离子体共振技术和新一代生物膜干涉检测技术等。近年来，基于这些新技术原理开发的仪器纷纷崭露头角，或能成为市场“黑马”。光栅耦合干涉技术光栅耦合干涉技术（Grating-Coupled Interferometry, GCI）由Creoptix AG（瑞士）开发。与传统的SPR技术相比，GCI技术巧妙的利用波导技术的原理，Creoptix WAVE产生的消逝波（evanescent field）仅在芯片表面与样品溶液接触，并且延长了其与样品相互作用的长度，以确保更低的信噪比(微量热泳动技术微量热泳动（MicroScale Thermophoresis, MST）是通过检测分子在微观温度梯度场中的运动来分析生物分子间相互作用的一种技术。将荧光检测的精准性与热泳动的灵活性及灵敏度结合起来，由红外激光建立微观温度梯度场，通过荧光染料标记、荧光融合蛋白、色氨酸自发荧光等信号追踪，分子在微观温度梯度场中的定向移动就可以被探测和量化，通过记录这个变化来计算出两个相互作用的分子之间的Kd值等重要参数。因为能够在液体环境中直接检测分子间相互作用力，MST技术成功避免了固定样品带来的使用上的局限。2010年底，德国NanoTemper公司创始人Dr. Stefan和 Dr. Philipp将MST测量生物溶液中蛋白-蛋白之间相互作用的研究成果发表在Nature杂志上，引起了很多科研人员的极大兴趣，随后NanoTemper公司基于MST技术开发的微量热泳动仪正式投入市场，并于2020年推出的新一代生物分子互作检测仪Monolith系列，提供更加简捷、快速并精准分析生物分子相互作用的分析方法。NanoTemper 新一代生物分子互作检测仪 Monolith（点击查看） 等温滴定量热技术等温滴定量热（Isothermal Titration Calorimetry, ITC）是一种是用于量化研究各种生物分子相互作用的一种技术，它可直接测量生物分子结合过程中释放或吸收的热量。ITC检测方式与化学反应中的酸碱滴定法相似，可以测定结合配偶体在自然状态下的亲和力，无需通过荧光标记或固定化技术对结合配偶体进行修饰。ITC技术通过测量结合过程中的热传递，就能够准确地确定结合常数 (KD)、反应化学量 (n)、焓 (ΔH) 、熵 (ΔS)和动力学数据（如酶促反应的Km和kcat）等重要参数。ITC技术具有快速、准确、样品用量小、对反应体系的要求不高（如对体系的透光度、浑浊度、粘滞度要求不高）等优势，被广泛应用于生物及医药等相关领域。商业化等温滴定量热仪最早出现在上世纪80年代后期，在过去的近30年中， ITC技术成为研究分子相互作用的常用方法之一。随着科学技术的发展，等温滴定量热仪将会更加灵敏、快速、易用。除此之外，还有许多基于主流技术流派开发出的一些新的分支流派，比如HORIBA scientific将等离子体共振技术、成像技术和微阵列芯片技术进行结合研发出的SPRi-OpenPlex灵活式表面等离子体共振成像系统，可以一次获取百种生物分子相互作用的信息；美国Biosensing Instrument将光学显微镜与SPR技术相结合开发的SPRm200系统，专为观察和测量细胞膜表面蛋白和其他目标分子结合亲和力及动力学常数，为分子相互作用的研究开辟了新的前沿；荷兰KEI研发的扫描角SPR技术，采用变化频率为76Hz的扫描镜改变入射光角度的方法，使光线产生4000m°的变化范围，从而提供更精确的测量结果；加拿大Affinité Instruments基于SPR原理开发出新一代非标记分子相互作用分析仪P4SPR，具有极大的便携性，且可与其它仪器（HPLC,MS等）联合使用。看到最后，相信大家对当前大分子相互作用仪的技术流派有了清晰的认识，但是心中也难免产生一丝丝疑惑，在纷繁复杂的品牌型号中，如何挑选到自己满意的大分子相互作用仪呢？敬请期待下篇——小编精选|大分子相互作用仪导购篇。(点击查看)