推荐厂家
暂无
暂无
我最近做4种磺胺类药物(磺胺嘧啶、磺胺吡啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺醋酰钠)和两种沙星类药物(培氟沙星、氧氟沙星)的前处理富集,样品基质暂定蜂蜜,但是做了一个月了,什么的提取不上来,试过液液分散萃取(氯仿、二氯甲烷、氯苯做萃取剂)、试过液液萃取(乙酸乙酯、二氯甲烷-乙酸乙酯、乙腈-氯仿做萃取剂)还有SPE(HLB柱子),都效果不好,六种目标物没法同时富集,最多就是一两种,而且回收率不高,头疼死了,求助啊,麻烦大家给出出主意吧,我还得靠这个毕业呢http://simg.instrument.com.cn/bbs/images/default/em09509.gif
一、案例磺胺类药物是一类应用最早的人工合成抗菌药物,能抑制革兰阳性菌及一些阴性菌,可以治疗多种细菌感染,具有抗菌谱广、疗效强等优点。磺胺类药物特别是磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶、磺胺甲基异嗯唑等作为饲料添加剂或动物疫病治疗药物被广泛应用。然而磺胺类药物在体内作用时间和代谢时间较长,过量使用必会导致磺胺类药物在食用动物产品中的蓄积。食品磺胺类药物残留,可引起过敏、中毒和导致耐药性菌的产生,它还能引起造血系统障碍,发生急性溶血性贫血、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血等。二、选用的标准农业部1025号公告-7—2008动物性食品中磺胺类药物残留检测——酶联免疫吸附法。三、测定方法1.样品的制备与保存取新鲜或解冻的空白或供试动物组织,剪碎,置于组织匀浆机中高速匀浆。取鸡蛋去除壳后用均质器500r/min匀浆20s,使蛋清和蛋黄充分混合。将已制备的样品在-20℃冰箱中储存备用。2.提取称取样品(2.00±0.02)g于50ml离心管中,加乙腈8mL,振荡20min,4000r/min离心5min:分取上清液2.5ml。于10mL离心管中,于50℃水浴下用氮气吹干;加正己烷1mL,涡动20s溶解残留物,再加缓冲液工作液1mL,涡动1min,4000r/min离心10min,取下层水相20μL分析。3.测定①使用前将试剂盒于室温(19~25℃)下放置1~2h。②每个标准溶液和试样溶液按两个或两个以上平行计算,将所需数目的酶标板条插入板架。③加系列标准溶液或试样液20μL于对应的微孔中,随即加酶标记物工作液50μL/孔,再加磺胺类药物抗体工作液80μL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板,置25℃避光反应60min。④倒出微孔中的液体,将酶标板倒置在吸水纸上拍打,以保证完全除去孔中的液体。再加洗涤工作液250μL/孔,重复操作两遍以上(或用洗板机洗涤)。⑤加底物液A液和B液各50μl/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板,室温下避光反应30min。⑥加终止液50μL/孔,轻轻振荡混匀,置酶标仪于450nm波长处测量吸光度值。4.结果判定和表述用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值的比值进行计算。相对吸光度值(%)=B/B0×100%式中 B一一标准(试样)溶液的吸光度值;B0——空白(浓度为0的标准溶液)的吸光度值。将计算的相对吸光度值(%)对应磺胺类药物标准品浓度(μg/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图,对应的试样浓度可从校正曲线算出。方法筛选结果为阳性的样品,需要用确证的方法进行确证。5.竞争物的交叉反应率见表1。表1竞争物的交叉反应率竞争物交叉反应率/%竞争物交叉反应率,%磺胺二甲嘧啶磺胺二甲氧嘧啶磺胺二甲基嘧啶磺胺嘧啶磺胺甲基异毂唑10023121%1%磺胺噻唑磺胺吡啶磺胺喹彀啉磺胺问甲氧嘧啶1%1%1%6.试剂①乙腈②正已烷③十二水合磷酸氢二钠。④二水合磷酸氢二氢钾。⑤氯化钠。⑥氯化钾⑦磺胺类药物快速检测试剂盒:2~8℃保存。a.系列标准工作溶液:O、1μg/L、3μg/L、9μg/L、27μg/L、81μg/L。b.包被有磺胺类药物偶联抗原的96孔板,12×8孔。c.磺胺类药物抗体工作液。d.酶标记物工作液。e.底物液A液。f.底物液B液。g.终止液。h.20倍浓缩洗涤液。i.20倍浓缩缓冲液。⑧洗涤工作液:用水将20倍浓缩液按1:19的体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水),用于酶标板的洗涤。2~8℃保存,有效期1个月。⑨缓冲工作液:用水将20倍浓缩缓冲液按1:19的体积比进行稀释(1份20倍浓缩洗涤液+19份水),用于酶标板的洗涤。2~8℃保存,有效期1个月。7.仪器①酶标仪(配备有450nm滤光片)。②氮气吹干装置。③均质器。④振荡器。⑤离心机。⑥天平(感量0.01g)。⑦微量移液器(单道20~200/μl、100~1000μL;多道250μL)。
液相色谱串联质谱法测定饲料中8种苯并咪唑类药物摘 要 建立了同时测定饲料中8种苯并咪唑类药物(噻苯咪唑、丙硫咪唑、硫苯咪唑、苯硫氧咪唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、丙氧苯唑和三氯苯唑)的液相色谱串联质谱分析方法。饲料样品直接用酸化乙腈提取,提取液用甲酸溶液稀释后直接进行分析。分析时采用XBridgeTM C18色谱柱,以甲酸溶液-乙腈体系进行梯度洗脱,MRM方式测定,基质外标法定量。苯并咪唑类药物在0.02~10 mg L-1浓度范围内呈良好的线性,线性相关系数均大于0.990,苯并咪唑类药物在饲料样品中最低检测限为2.1~63.0μg/kg。饲料中苯并咪唑类药物在0.50~200 mg/L范围内的回收率为84.0%~104%之间,相对标准偏差(RSD)均小于10%。 关键词 苯并咪唑类药物;液相色谱串联质谱法;饲料 苯并咪唑类药物(benzimidazoles, BMZs)属于广谱、高效、低毒抗蠕虫药,由于对胃肠线虫具有很强的驱杀作用,至今仍在广泛使用。但由于BMZs在实验动物和靶动物显示致畸和致突变作用,目前使用的BMZs多数是食品残留中重要的监控对象,且BMZs在体内转化的代谢产物仍具有毒理作用,所以我国以及联合国粮农组织、欧盟、美国、日本等国家和组织都将苯并咪唑类药物列入限制使用的兽药药物,并制订出各种苯并咪唑类药物在不同动物体内(肌肉、组织、奶等)的最高残留限量。饲料安全直接关系到动物性食品的安全,考虑到苯并咪唑类药物经常被添加到饲料中使用,故很有必要进行饲料中苯并咪唑类药物的分析研究。 目前对于动物组织中苯并咪唑类药物的分析方法较多,而饲料中苯并咪唑类药物分析方法国内未见发表,国外也较少,涉及的种类也较少,最多的仅有5种药物。动物组织和饲料中BMZs分析涉及的主要分析手段有:酶联免疫吸附法( ELISA) 、气相色谱-质谱法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)及高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS),高效毛细管电泳法(HPCE)。考虑到苯并咪唑类药物在我国使用情况,本研究选择了8种常用苯并咪唑类药物,考虑到LC-MS/MS法灵敏度高的特点,样品酸化乙腈提取后直接稀释后进行液相色谱串联质谱分析。1 材料与方法1.1 仪器与试剂 Waters 2695 Quattro MicroTM API高效液相色谱串联质谱仪(美国Waters公司),配置电喷雾离子源;固相萃取仪(美国Supelco 公司);Sigma离心机。噻苯咪唑和丙硫咪唑标准品(Accustandard 公司);硫苯咪唑、苯硫氧咪唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、丙氧苯唑和三氯苯唑标准品(Dr. Ehrenstorfer)。乙腈、二甲亚砜和甲酸为色谱纯(Fisher公司)。1.2 仪器条件 XBridgeTM C18色谱柱(150 mm×2.1 mm,内径3.5 μm);流动相A为0.1%甲酸溶液,B相为乙腈,梯度洗脱条件:B相在1.0 min内从15%线性增加到25%,再在2.5 min内线性增加到95%,保持3.5 min,然后在0.1 min内降至15%,保持4.9 min;流速:0.3 mL/min;进样量:10 µL;柱温:30℃。 质谱条件:ESI源正离子模式电离;多反应监测(MRM);毛细管电压:3.0 KV;萃取锥孔电压:20 V;RF透镜电压:0.5 V;离子源温度:110 ℃;脱溶剂气温度:350 ℃;锥孔气流速:50 L/h;脱溶剂气流速:600 L/h;倍增器电压:650 V;二级碰撞气:氩气;其它条件详见表1。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/11/201011301506_262957_1759541_3.jpg1.3 样品处理 称取2g试样(精确到0.01g)于50 mL离心管中,加入20 mL0.5 %甲酸乙腈,涡旋1 min,然后超声提取10 min,以5000 r/min的速度离心5 min后吸取1.0 mL上清液于5 mL刻度试管中,加入3 mL0.1 %甲酸溶液于试管中,混匀后过0.22 μm滤膜,进行液相色谱串联质谱分析。1.4 线性实验 准确称取各10.0 mg BMZs标准品于相应的10mL容量瓶中,噻苯咪唑、甲苯咪唑、丙氧苯唑和丙硫咪唑用二甲亚砜溶解并定容至刻度,其余4种BMZs用甲醇:二甲亚砜(2:3 v/v)溶解并定容至刻度,即得均为1000 mg/L标准储备液。分别吸取1.0 mL各标准储备液于同一10mL容量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即得100 mg/L的混合标准工作液。分别准确移取苯并咪唑类药物混合标准中间液适量,配制浓度为0.2.、0.8、2.0、10.0、40.0和100.0 mg/L的系列标准溶液,吸取0.1 mL于5 mL刻度试管中,再吸取空白试料提取液0.9 mL于该5 mL刻度试管中,加入3 mL0.1%甲酸溶液后混匀过膜,进行上机测定,以定量离子对峰面积为纵坐标,标准溶液浓度为横坐标,绘制基质校准标准曲线。2 结果与分析2.1 液相色谱质谱分析 苯并咪唑类药物色谱分析时,通常采用反相分离体系,主要有三类流动相体系:离子增强体系,pH2~3,一般使用乙腈-磷酸或磷酸盐体系;离子抑制流动相体系,pH5~7;离子对流动相体系,离子增强流动相中加入阴离子对试剂。对于多组分苯并咪唑类药物液相色谱质谱分析时,通常采用离子增强体系进行梯度洗脱,如0.1%甲酸溶液-乙腈体系,因为该体系和纯水-乙腈体系相比色谱峰的拖尾现象得到了明显改善。 苯并咪唑类药物属弱碱性物质,中等极性,在酸性条件下很容易质子化,于是本方法选择ESI+进行分析。以乙腈/0.1%甲酸溶液(3:7,v/v)为溶解液,用蠕动泵(20μL/min)对苯并咪唑类药物的质谱条件进行优化。经过优化的条件为:毛细管电压:3.0KV;离子源温度:110℃;脱溶剂气温度:350℃;锥孔气流速:50L/h;脱溶剂气流速:600L/h。其它条件详见表1。2.2 提取净化方法的选择和优化 [font=宋体