板蓝根

质谱成像技术揭示板蓝根中化学成分的空间分布 板蓝根（Isatidis Radix）为十字花科菘蓝属植物菘蓝（Isatis indigotica Fortune）的干燥根，具有清热、解毒、凉血、利咽等功效。作为清热解毒类的代表药物，板蓝根与广泛用于各类感冒的预防和治疗，在严重急性呼吸综合征（SARS）、甲型H1N1流感等疾病的防治中发挥了积极作用。新型冠状病毒肺炎（COVID-19）爆发以来，各版《诊疗方案》和“三药三方”中也不乏板蓝根的身影。板蓝根的抗病毒抗炎药效显著，但化学成分复杂，质量评价难度较高，因而一直是国内外研究的热点。 目前研究学者已经从板蓝根中分离得到近400个化合物，综合文献报道主要可归纳为生物碱、含硫化合物、苯丙素、核苷、氨基酸、有机酸、酚、黄酮、蒽醌、萜、醇、醛、酮、腈、酯、糖、甾醇、肽、鞘脂等19大类。研究药用植物化学成分的空间分布，有助于了解其形态学结构和功能。尽管板蓝根的化学成分研究已经十分深入，但其分子空间分布鲜见报道。质谱成像（mass spectrometry imaging，MSI）技术是近年新兴的分子成像技术，通过直接测定样品表面的离子信号获得其空间分布信息，具有非靶向、无需标记和多成分同时检测的优势。与光学图像采集技术结合后，既可观察到高分辨率的形态图像，又可对特定的分子进行鉴定和可视化分布分析，在生命科学领域显示出巨大的应用前景。本文首次采用高分辨质谱成像技术对板蓝根化学成分的空间分布进行分析。利用大气压基质辅助激光解吸电离-离子阱-飞行时间质谱（atmospheric pressure matrix assisted laser desorption combined with ion trap-time-of-flight mass spectrometry，AP-MALDI-IT-TOF/MS）扫描不同产地药材横切面，鉴定所含化合物，并观察化合物空间分布模式和富集位置，结合偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）算法，对不同样品进行分类。研究思路见图1。 图1 AP-MALDI-IT-TOF/MS成像技术揭示板蓝根中化学成分的空间分布 1. iMScope TRIO 成像质谱显微镜测试条件质谱成像技术在植物、动物、人体组织中的内源性成分和药物代谢组分的可视化检测方面发展迅猛，但在中药分析领域的应用才刚开始起步，且多用于新鲜采集的原植物或中药材。而真正用于市场流通和临床应用的中药材为干品，制备满足MSI测试需要的切片比较困难，故相关研究鲜见报道。在制备板蓝根干品冰冻切片时，其干燥、坚硬、易碎的结构带来了极大的挑战，故对冷冻切片的厚度、温度，切片固定方式，基质种类和添加方式等进行了详细的优化。板蓝根药材经明胶包裹冷冻后，先用双面碳导电胶贴牢后，再用冰冻切片机切制40 μm的组织切片，分别喷涂2, 5-DHAP溶液和1, 5-DAN溶液作为正、负离子的基质。主要质谱条件如下：激光照射直径：40 μm，像素间隔80 μm，扫描范围：m/z 100-500，m/z 500-1000。 2. 板蓝根中化合物的AP-MALDI-IT-TOF MSI可视化分布根据离子的准确质荷比、同位素丰度比，与对照品和液质一、二级数据比对，并结合文献检索和数据库搜查，初步鉴定了多个化合物类别118个质谱峰（见图2）。成像质谱显微镜将光学显微镜和质谱仪的优势整合，既可观察到形态图像，又可对分子进行鉴定和可视化分布分析，在软件上可简便且高精度地重叠观察光学显微镜图像与质谱分析图像，详细解析感兴趣区域。本文采用AP-MALDI-IT-TOF MSI技术首次揭示了板蓝根中化合物的空间分布， 图3和 图4展示了板蓝根横切面的木栓层、皮层、韧皮部、形成层、木质部及部分化合物在特定空间区域的分布。综合分析，板蓝根中化合物大多富集于营养储存的组织韧皮部，与之相比，水分输送组织木质部中集中分布的成分较少。 图2 板蓝根MALDI-IT-TOF MS成像化合物鉴别结果图3 板蓝根横切面光学图 (a) 和oxindole (b)、3-[2' -(5' -hydroxymethyl) furyl]-1(2H)-isoquinolinone-7-O-β-D-glucoside (c)、coniferin (d)、guanine (e)、histidine (f)、 proline (g)、arginine (h)、cyclo(L-Phe-L-Tyr) (i)等成分正离子质谱成像图 图4 板蓝根横切面光学图 (a) 和 isatindigoside F (b)、clemastanin B (c)、maleic acid (d)、malic acid (e)、citric acid (f)、sucrose (g)、isovitexin (h)、vanillin (i) 等成分负离子质谱成像图 3. PLSR法区分不同产地板蓝根药材将4个产地的各3批板蓝根药材分别划分到4个组。以样品横切面的AP-MALIDI-IT-TOF MSI数据为Y值，组别为X值，在正、负离子模式和m/z 100-500、m/z 500-1000两个扫描范围内，分别建立PLSR回归模型。由图5可见，在4个模型中，样品规格的预测值和实际值均呈现良好的相关关系，说明采用PLSR法可对不同产地的板蓝根进行准确的区分。 图5 MALDI-IT-TOF MS成像结合PLSR回归区分不同产地板蓝根样品 正离子m/z 100-500范围 (A)、负离子m/z 100-500范围 (B)、正离子m/z 500-1000范围(C)、负离子m/z 500-1000范围 (D) 本文相关内容由中国食品药品检定研究院的聂黎行研究员提供，详细研究内容已正式发表于Frontiers in Pharmacology - Ethnopharmacology, 2021, https://doi.org/10.3389/fphar.2021.685575。 文献题目《Microscopic Mass Spectrometry Imaging Reveals the Distributions of Phytochemicals in the Dried Root of Isatis indigotica》 使用仪器岛津iMScope TRIO 作者Li-Xing Nie1,2, Jing Dong3, Lie-Yan Huang2, Xiu-Yu Qian2, Shuai Kang2,4*, Zhong Dai2 and Shuang-Cheng Ma1,2*1 Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing, China2 National Institutes for Food and Drug Control, National Medical Products Administration, Beijing, China3 Shimadzu China Innovation Center, Beijing, China4 College of Pharmacy, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang, China

5月18日，距离成都约50公里的广汉市经济开发区内，蜀中制药依然保持表面的平静。不时有运货车辆进出，很多职工也在正常上班。但厂区的保安明显警惕了很多。陌生人一旦接近厂门附近，便会遭到盘问。 　　这家四川省内知名的普药生产企业已经处于半瘫痪状态。 　　5月16日起，多位医药界人士陆续向本报记者爆料称：四川蜀中制药已被停产整顿，问题可能出在公司的几个中药品种上，板蓝根颗粒以及复方丹参片涉嫌出问题。 　　5月19日，四川省食品药品监督管理局确认：蜀中制药违反药品GMP相关规定，已责令停产整顿。省局已经收回蜀中制药的中药生产线GMP证书。 　　药监局的通报 　　5月18日，本报记者设法进入蜀中制药工厂后，也并未能参观全部厂区，而只是被限定在厂区广场范围之内。透过公司主楼的玻璃大门，可以看到厂区内一个制剂车间大门处于关闭状态。 　　公司保安人员称：“只有经过安总的批准，才能进入厂区参观。”由于公司董事长安好义出差在外，记者最终也没能现场确认公司的生产现状。 　　不过，四川当地制药企业负责人肯定的表示：“5月初，四川省药监局组织省内企业召开过一次内部会议，会上通报了蜀中制药被停产整顿的问题，板蓝根和复方丹参片两条生产线涉案。省药监局已经口头通知各经销商暂时不从蜀中制药进货。”他同时表示：“今年4月底成都药交会举办的同时，国家药监局已经在开展调查了。” 　　四川省药监局答复函显示的信息与爆料人的说法一致：今年4月份，国家局的飞行检查和省局的日常检查都发现了蜀中制药违反GMP相关规定。 　　5月18日，接近国家药监局的高层人士向记者确认：“蜀中制药董事长安好义已经被国家局约谈多次，此案目前由国家药监局高层亲自督办。调查结果尚未公布。” 　　上述人士的这一说法与药监局近期的工作重点不谋而合：5月6日，国家药监局网站发布了一条通知，要求深入开展基本药物生产和质量监督检查。其中明确提到，要对“原辅材料的采购、入库、投料、中间产品制备情况”等严格检查，并要求各省级药监在今年6月30日前将检查结果上报国家药监局安监司。 　　对于蜀中涉案具体问题，多位消息人士说法一致，即虚假投放原料，甚至“以苹果皮代替原料”。由于蜀中制药所生产的多款基本药物在全国多个省份都有中标，因此其影响可能已经波及全国。 　　2005年，齐齐哈尔第二制药厂曾违反规定，将工业原料二甘醇用于药品生产，导致南方省份多人用药后死亡。“齐二药”事件直接导致了时任药监局局长的郑筱萸被判处死刑，引发国内药监系统一轮地震。 　　上述高层人士表示：“蜀中制药的确存在虚假添加原料的行为，涉嫌以工业加工的中药提取物代替中药材进行生产。”至于多位爆料人反映“苹果皮入药”的问题，上述人士并未肯定。 　　《中国药典》中将氨基酸类成分进行薄层色谱和化学反应鉴别作为板蓝根质量控制标准之一，但无含量测定项。医药界人士介绍，苹果皮里面精氨酸和亮氨酸含量特别高，苹果皮可冒充板蓝根，骗过目前的检测方法，企业因此可达到削减成本的目的。 　　据医药协会人士称，国家药监局早就察觉到蜀中制药存在问题，此时出手整顿，早已在计划之内。 　　由于调查结果可能会在6月30日统一公布，因此国家局尚未组织对蜀中制药的产品进行召回。但据南方某经销商透露：“蜀中制药已经在自行组织回收药品。” 　　“迟早出事” 　　对于蜀中制药问题的曝光，川内多家制药企业负责人均未表现出诧异，而是感叹：“蜀中这样做法，被查出来是早晚的事情。” 　　爆料人表示：“蜀中制药在安徽低价中标基本药物，引起了国家药监局的关注。道理很简单，其产品的中标价格竟然低于原料成本。真不知道里面到底是什么成分。” 　　2010年9月15日，安徽公布的基本药物第三批中标结果中，蜀中制药120片规格的复方丹参片(薄膜衣片)中标价为2.99元。而国家基本药物零售指导价，该规格复方丹参片最高限价为14.1元。2010年8月30日公布的一批中标结果中，蜀中制药10g×20规格的板蓝根颗粒中标价为 2.35元，而国家指导价为10.8元。 　　国家指导价是根据业内成熟企业的平均成本加上一定利润率而得出的。也就是说，蜀中的成本仅为全行业成本水平的20%左右，这本身就是一件令人惊讶的事情。尤其是2010年下半年开始，中药材价格遭遇一轮疯炒，各家企业成本压力骤增，而蜀中尚能淡然面对，逆市降价应标，实在令人不可思议。 　　蜀中制药内部人士向记者介绍：“公司拥有三七、丹参、板蓝根的种植基地，成本控制能力是有保障的。”同时她也承认，安徽是全国基本药物招标的第一省，“公司也是趁政策刚出时拼了一把，想夺取市场”。 　　安徽在全国开创了“唯低价论”的基本药物中标模式。在质量标准一致的前提下，价低者得市场。由于国内普药生产商大多执行GMP标准，仅少数企业享有单独定价权，因此价格事实上成为唯一的评价标准。而且，由于是试点省份，安徽的中标结果对其他省份都有重要的指导意义，因此蜀中才不遗余力地挤入安徽基药市场。 　　在安徽基药招标之前，作为普药生产大户，蜀中一直因低价而饱受非议。 　　此前业界也有风言风语称蜀中用料不规范。为此，国家发改委曾在2010年11月19日派社会发展司医改二处副处长李瑶光、王谈凌等组成调查组，对蜀中制药进行了一轮深入调查，特别对其阿莫西林胶囊、板蓝根颗粒、复方丹参片、牛黄解毒片等几个大宗品种进行考察。事后，发改委官员认为“蜀中药品质量内控标准依据法定标准制定，检查项控制指标较法定标准均有所提高”。全面肯定了蜀中的质量管理水平，也让众多质疑企业彻底闭口。 　　彼时距离国家药监局飞行检查查出问题，仅有5个月时间。 　　“普药狂人”安好义 　　“招标只看价格，这是逼着企业去造假” 　　蜀中制药董事长安好义素有“普药狂人”之称，在中国医药界也是地方“重量级”人物。 　　公司内部也从不讳言蜀中制药的发家史：安好义的父辈在河南、湖北一带做药材生意，“靠囤积药材起家”。2009年，安好义来到四川，收购了现在的蜀中制药。安本人也是凭借2003年非典期间，囤积了大量的板蓝根原材料，在板蓝根紧俏之时一直保持满负荷生产。这才奠定下事业发展的基础。 　　2010年，蜀中制药销售额20亿元左右，其中中药部分约占14亿。安好义同时还是国内“第三终端第一人”，其产品以基层医院和农村市场为主，目前各级医院市场占公司销售额的60%左右。 　　在安好义的规划中，蜀中制药将在未来10年保持年均20%的增幅，争取在2020年达到百亿规模。安好义已经在公司现址周围又买下两块地皮，用于扩产和员工住房福利，预计完全建成后公司规模将较现在扩大两倍以上。 　　普药利润率偏低，安好义也深刻地体会到这一点，因此一直在筹资投入新药研发。据称建银医疗基金等私募曾对蜀中示好，公司也有迈入资本市场的打算。 　　不过，此次停产事件可能会彻底粉碎蜀中的“十年愿景”。川中同行在表示惋惜的同时，也纷纷表现出对基本药物招标制度的异议。 　　相关医药协会人士解读：“招标只看价格，这是逼着企业去造假，是置老百姓用药安全于不顾的政策。” 　　石药集团董事长蔡东晨在今年两会期间反复表示：“价格虚低比价格虚高更危险。某品种安徽中标价是1.25元，山东中标价1.22元。而光原料价格就高达每瓶1.1元，中标企业必然亏损。除了拿别的品种利润补贴这一品种的亏损，那就只有造假。” 　　彼时的危言耸听终于在今日成为现实。据知情人士透露，国家药监局在5月份开始的基药质量大检查中，已经查出多家问题企业，“蜀中制药只是中成药方面的问题，另有企业的西药生产线也已停产整顿。”具体的调查结果，有待国家药监局在6月30日将资料汇总后公布。 　　“齐二药”那样的企业还会不会重新浮现，仍待检验。

近日，药典委发布关于板蓝根含片国家药品标准草案的公示，标准编号：WS3-166(Z-166)-2002Z，批件2002ZFB0045所附标准。拟制定科学、合理和通用的板蓝根含片国家药品标准。此次公示为期三个月，相关人员可在线对草案进行反馈。以下为公示原文：https://www.chp.org.cn/?#/business/standardDetail?id=66864eb1bd8c788218573c1f板蓝根含片国家药品标准草案起草说明：1、 修订了板蓝根薄层鉴别方法 2、 删除了靛玉红的含量测定，建立了尿苷、鸟苷、腺苷的含量测定方法。 3、 板蓝根含片素片和薄膜衣片质量标准合并为一个标准。 4、规格规范为每片重 0.5g（相当于饮片 1g）除此之外，国家药典委员会发布了一系列的方法通则修订草案，公开征求意见，相关新闻可点击下方专栏关注。