液体标准

3月13日，全国制糖标准化技术委员会(以下简称标委会）发布《关于征求行业标准〈液体糖〉(征求意见稿)》，请标委会委员及各有关单位高度重视、积极参与、认真研究并提出书面意见，于2023年4月25日前将意见反馈至标委会秘书处。 附件1:《行业标准《液体糖》征求意见稿》附件2:《《液体糖》(征求意见稿)编制说明》附件3:《行业标准征求意见表》

各位专家：根据国家标准化管理委员会“关于下达2022年第一批推荐性国家标准计划及相关标准外文版计划的通知”（国标委发[2022]17号），其中《液体荧光氧分析仪的性能表示》（项目代号20220062-T-604）为国家标准制定项目，等同采用国际标准IEC 62703；《分析仪器系统维护管理》（项目代号20220061-Z-604）为国家标准化指导性技术文件制定项目，等同采用国际标准IEC TR 62010和《安全仪表系统—过程分析技术系统》（项目代号20220060-Z-604）为国家标准指导性文件制定项目，等同采用国际标准IEC TR 63176。根据工业和信息化部办公厅关于印发“2021年第三批行业标准制修订计划的通知”（工信厅科函[2021]234号），其中《荧光光度计》（计划编号2021-1373T-JB）为行业标准修订项目。以上计划项目的主管单位为中国机械工业联合会，技术归口单位为全国工业过程测量控制和自动化标准化技术委员会分析仪器分技术委员会（SAC/TC124/SC6）。应各标准起草工作组要求，按照标准制修订程序及《全国工业过程测量控制和自动化标准化技术委员会分析仪器分技术委员会章程》有关规定，特向社会公开征求意见。欢迎社会各界学者、专家针对标准内容提出建议和修改意见，并于2023年10月28日前将征求意见回执填好，签名后通过电子邮件反馈至秘书处。回函请务必留下您的联系方式，方便秘书处与您联系。联系人：闫海荣 手机：13331133182（微信同号）E-mail: yanhr@cima.org.cn或yanhairong2000@163.com地址：北京西城区百万庄大街16号全国工业过程测量控制和自动化标准化技术委员会分析仪器分技术委员会秘书处2023年9月11日附件：1.征求意见回执2.液体荧光氧分析仪的性能表示（征求意见稿）3.分析仪器系统维护管理（征求意见稿）4.过程分析技术系统—安全仪表系统（征求意见稿）5.荧光光谱仪（征求意见稿）

p 　　非小细胞肺癌是最为常见的肺癌，占肺癌总数的80%，其治疗前需检测EGFR基因突变已成共识。这篇文章主要为大家介绍非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测的三个重要环节——标本采集及处理、cfDNA的提取、EGFR突变检测。 /p p 　　非小细胞肺癌(NSCLC)中EGFR基因突变状态与EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)疗效预测的相关性早已被证实，NSCLC治疗前需检测EGFR基因突变也已成共识。但是在临床实践中，首先，多数肺癌患者确诊时往往已到晚期，其中相当部分肿瘤组织标本难以获取，导致无法进行EGFR检测 另外，部分患者肿瘤内EGFR基因突变的异质性使基于基因检测的靶向治疗决策变得更加困难 最后，我国的EGFR基因突变检测在肺癌患者中的受检率相对偏低，吉林肿瘤医院程颖教授在2017 WCLC会议报告上指出：相对于欧美接近100%的检测率，中国北方三级甲等和肿瘤医院中，肺癌的EGFR检测率也仅仅只有46%。因此，针对临床实践中肿瘤组织检测的种种局限，探寻作为其补充或替代的其他生物标本进行EGFR基因检测具有重要临床意义，也有助于提高临床患者的总体EGFR基因受检率。 /p p 　　近些年，以血液等为样本基础的液体活检技术飞速发展。多项研究表明[1-3]，大部分晚期NSCLC患者的血液中存在循环游离DNA(cfDNA)及循环肿瘤DNA(ctDNA) 并且已有研究显示外周血ctDNA EGFR基因突变检测结果对EGFR-TKIs疗效有预测作用[2，4-5]。因此，当肿瘤组织难以获取时，无创、易采集的血液检测就是组织EGFR基因突变分析合适的替代选择，并且血液检测在一定程度上能有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测等。 /p p 　　标准化的检测流程是保障ctDNA-EGFR血液检测质量的前提，临床专家对于血液检测应用规范问题也多有探讨，并于2015年12月8号在《中华医学杂志》上发表了由吴一龙、王洁等教授整理的《非小细胞肺癌血液EGFR基因检测中国专家共识》。其中，标本采集及处理、cfDNA的提取、EGFR突变检测是血液检测的三个重要环节。 /p p 　　一、血液EGFR基因突变检测之标本采集及处理 /p p 　　1.患者选择 /p p 　　研究显示，肿瘤分期越高，ctDNA检出率越高[6]，即III或IV期的肿瘤患者血液中的ctDNA相较Ⅰ/Ⅱ期的患者含量更高，更容易被检出。因此，为提高血液EGFR检出率，建议选择晚期患者。 /p p style=" text-align: center " img title=" 1.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/2cc1a428-d0b1-4c64-8c2e-368497e47080.jpg" / /p p 　　须知药物治疗过程中，EGFR突变情况以及ctDNA的浓度可能发生变化。如下图所示[7]： /p p 　　 /p p style=" text-align: center " img title=" a.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/919ec6f9-3664-418b-b2dc-d131f8e4ccfb.jpg" / /p p style=" text-align: center " img title=" b.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/472d89d1-5298-422c-a14a-7fbdc29b9739.jpg" / /p p 　　2.标本采集及分离 /p p 　　全血中血浆和血清均能分离出ctDNA，但研究显示，相对于血清标本，血浆中ctDNA有更高的检出率[8]。另外，对同一患者，血浆量越多所提取的DNA量就越多，其中含有的cfDNA量就越多，对检测越有利[9]，如下图所示： /p p style=" text-align: center " img title=" 2.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/22d906f0-ad21-4f4f-9a1d-f147d3736964.jpg" / /p p 　　因此按照专家共识[10]建议采集10ml全血(可分离4-5ml血浆)，采集完成后需温柔颠倒混匀，以便于抗凝剂或保护剂充分与血液接触。 /p p style=" text-align: center " img title=" 3.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/2e2d87f7-2229-4f0d-b9ab-eadf8eebfc8b.jpg" / /p p 　　此时需根据使用的采血管类型(常规EDTA抗凝管/专用常温采血管)进行不同的后续操作。 /p p 　　(1)：用常规EDTA抗凝管采集全血后，为防止游离DNA的降解，避免野生型DNA背景的增加，建议两小时内以足够的离心力将全血充分低温离心两次[11]，分离出不含细胞成分的血浆，吸取操作如下图所示，分离出的血浆放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤(备注：离心前临时保存应暂放于2~8℃冷藏) /p p style=" text-align: center " img title=" 4.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/c1ccb097-a166-4380-a390-fbe78232f4fb.jpg" / /p p 　　(2)：用含有游离DNA保护剂及防细胞裂解保护剂的专用常温采血管采集后轻摇混匀，常温放置不超过5-7天，以足够的离心力将全血充分离心两次，分离出不含细胞成分的血浆，放置于-70℃冻存直至DNA抽提，或直接进入DNA抽提步骤。如果外送运输全血，建议使用cfDNA专用常温采血管。 /p p 　　禁用肝素抗凝管：由于肝素使得DNA抽提得率降低并在DNA提取过程中难以去除，肝素也会导致PCR效率降低，因此cfDNA检测血液采集禁用肝素抗凝管。 /p p 　　3.血浆质量评价 /p p 　　(1)血浆是否溶血：如发生严重溶血，标本不可用，血红蛋白及其代谢产物可能抑制Taq酶活性，使PCR扩增效率明显降低。 /p p style=" text-align: center " img title=" 5.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/830e3e22-ba2f-4c9d-a408-3d5fb0c6b086.jpg" / /p p 　　(2)血脂是否过高：血脂过高，使血浆呈乳白色，低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收作用，故对PCR有干扰。 /p p style=" text-align: center " img title=" 6.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/549887d8-7299-4eb1-87dc-802720c81f7b.jpg" / /p p 　　二、血液EGFR基因突变检测之cfDNA提取 /p p 　　10ml全血分离出的4-5ml血浆用于cfDNA的提取，目前可用于cfDNA提取的方法很多，有实验室自建方法，也有商用核酸提取试剂盒。建议采用国家药监部门批准的、大容量血浆游离DNA分离试剂盒。 /p p 　　所提取的cfDNA建议马上使用，若不能立即进行后续检测而需要储存cfDNA，首选-80℃冰箱冻存。若无-80℃冰箱，可选择-20℃保存，应尽可能缩短冻存时间，尽快进行后续检测。冻存时注意密封及标记完整，避免反复冻融。 /p p 　　三、血液EGFR基因突变检测 /p p 　　中国国家食品药品监督管理总局(CFDA)在2015年2月批准吉非替尼说明书更新，可通过血液ctDNA检测EGFR基因突变指导吉非替尼治疗。近期，CFDA更是通过创新医疗器械特别审批的方式，快速批准艾德生物自主创新产品Super-ARMS& reg EGFR检测试剂盒(Super-ARMS技术是在原有ADx-ARMS技术优势基础上，优化引物探针设计和反应体系，将检测灵敏度提升至0.2%，完全适用于对灵敏度要求更高的血液检测领域)用于血液ctDNA-EGFR基因突变的检测。由此可见，ctDNA-EGFR标准化检测的时代已经到来! /p p 　　为了降低假阳性概率，推荐使用经国家药监部门批准的高敏感度的检测方法用于ctDNA样本的EGFR基因突变检测。专家共识中也指出，检测必须在具有资质的检测中心进行。检测方法必须进行严格的验证及质控。检测试剂须使用经CFDA批准的检测试剂盒。目前，检测基因突变最常用的方法是扩增阻遏突变系统(ARMS法)，欧盟批准用于指导吉非替尼治疗的血液检测方法也是ARMS检测方法。而Super-ARMS& reg 方法是CFDA批准用于血浆中EGFR突变检测的敏感度最高的ARMS方法，其检测灵敏度可达0.2%。 /p p 　　根据今年ESMO(欧洲临床肿瘤协会年会)大会上，上海肺科医院周彩存教授、广东省人民医院吴一龙教授等多位肺癌权威专家共同发布的AURA 17扩展研究数据可知[12]，Super-ARMS& reg 技术检测血浆T790M突变的阳性检出率仅次于目前灵敏度最高的ddPCR技术，更重要的是，Super-ARMS& reg 技术检出的血液T790M突变阳性患者服务奥希替尼的客观响应率(ORR)最高，高达64%，说明灵敏度0.2%的Super-ARMS& reg 技术是临床血液ctDNA检测的最优选择，疗效预测的准确性最高，是血液检测临床应用的可靠技术。 /p p style=" text-align: center " img title=" 7.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/a08b6be8-40f3-4c0b-9814-93e8d084bf6d.jpg" / /p p 　　总之，血液EGFR突变检测的标准化、合规化是保证检测准确率的核心，在减少操作流程对检测结果影响的前提下，选择经国家药监部门严格审批上市的检测产品和合规专业的检测机构也是至关重要的。 /p