端粒酶检测

美国科学家近日发现了一种功能极似端粒酶的蛋白质，它能四处运送至关重要的蛋白质块来修复在正常复制中被丢失的染色体末端。如果没有这样的日常维护，干细胞将很快停止分裂，胚胎也将无法发育。 　　这是10年来首次发现端粒酶的新蛋白组分，这也许将成为抗癌疗法的一个有价值靶标。该项研究成果刊登在1月30日出版的《科学》杂志上。 　　端粒酶可在成体干细胞、免疫细胞和正在发育的胚胎细胞中正常表达。在这些细胞中，端粒酶附着在新复制的染色体末端，从而使细胞的分裂不受约束。如果没有端粒酶，细胞将停止分裂，或在有限数目的分裂后死亡。不幸的是，这种酶在许多癌细胞中也很活跃。研究人员发现，阻止这种称为TCAB1蛋白的不恰当表达，也许能限制端粒酶到达其DNA靶标(端粒)，并限制细胞的寿命。 　　研究人员表示，目前还没有有效的端粒酶抑制剂。多年来，端粒酶一直是研究热点，但科学家们困扰于其大尺寸和极其少量。成人体内的少数细胞可制作出这种巨型蛋白复合物，但制作量非常之少，因此只有端粒酶的部分成分已被确定。研究人员称，要找出端粒酶的所有蛋白成分是一项难以置信的巨大挑战，端粒酶中的未知成分甚至被称为“暗物质”。 　　美国斯坦福大学医学院的研究人员使用高灵敏的蛋白鉴别技术(质谱)，找到了端粒酶中TCAB1的存在。去年年初，研究人员曾利用相同的技术首次确定了另两种蛋白pontin和reptin，这两种蛋白对端粒酶这种巨型复合物的形成非常重要。此次，研究人员则确定了TCAB1蛋白具有以前未知的功能。 　　与pontin和reptin不同的是，TCAB1是端粒酶的一个真正组成部分。但它对酶的活性来说并不是必需的，它只是给称为卡哈尔体(Cajalbodies)的细胞核中的处理和保持区域补充端粒酶复合物。卡哈尔体将对各种使用RNA小分子来引领其活性的蛋白进行修饰，譬如，端粒酶使用RNA分子作为嵌在染色体末端的DNA链的模板。在适当的时候，TCAB1将端粒酶复合物运送到新复制染色体的等待端。 　　研究人员表示，TCAB1对端粒酶完成从卡哈尔体到端粒的跳跃是绝对必需的。一旦抑制其在人类癌细胞中的活性，端粒就会变短，这也意味着癌细胞会更快地死亡。研究人员认为，TCAB1蛋白可能是一种负责将各种分子运往其目的地的普通生物运输器。下一步，研究人员将继续对TCAB1进行研究，并寻找端粒酶的其他组成部分。

近日，约翰霍普金斯大学医学院Carol W. Greider团队在Science发表了题为“Human telomere length is chromosome end–specific and conserved across individuals”的文章，介绍了一种基于纳米孔测序技术的端粒分析方法——Telomere Profiling，可以单核苷酸分辨率测量细胞中每个端粒的长度。Carol W. Greider曾与Elizabeth Blackburn、Jack Szostak以”发现端粒和端粒酶是如何保护染色体的“这一研究成果，获得2009年诺贝尔生理学或医学奖。研究团队利用这一新方法对 147 个个体的染色体端粒长度进行分析，发现端粒中位长度为 4.7kb，但不同染色体端粒长度差异极大，平均值相差超6kb。特别地，这种染色体末端特异性端粒长度差异具有个体保守性，在出生时就已确定，随年龄增长也得以保持。这一发现对于理解端粒生物学、衰老过程以及相关疾病的发生具有重要意义。综上，Telomere Profiling方法易于实施、结果精确并且成本较低，可广泛应用于科学研究和临床诊断，将使探索端粒生物学的全新领域成为可能。文章发表在Science主要研究内容:1.纳米孔端粒分析准确且可重复报告端粒长度为确定人类端粒是否在所有染色体上保持共同的长度分布，或者特定的染色体末端是否保持自己独特的长度分布，研究团队开发了一种富集、分析端粒的方法Telomere Profiling：首先使用生物素化的寡核苷酸（TeloTag）标记端粒末端；随后用链霉亲和素分离标记的端粒，并通过限制性内切酶酶切将其释放；最后通过牛津纳米孔技术（ONT）长读长测序方法对端粒进行测序。据悉，使用该方法检测每个样本的成本约为75美元。此外，研究团队还开发了新生物信息学分析流程来确定染色体末端特异性端粒长度。接下来，研究团队通过对0岁至90岁人群的外周血单核细胞（PBMC）进行了端粒分析，并将其与Southern印迹法、FlowFISH检测的结果进行对比。结果显示，经不同方法所检测的端粒长度高度一致，表明Telomere Profiling方法具有高度准确性及优异可重复性。此外，研究团队还通过检测7个样本的端粒长度来检测实验室间的差异性，确认了该方法的广泛适用性和可靠性。图1. 纳米孔技术进行端粒分析是准确和精确的2.端粒长度随年龄增长而发生变化已知端粒长度随着年龄的增长而缩短，但先前方法无法在核苷酸分辨率上测量端粒长度。为检测端粒长度动态范围，研究团队使用Telomere Profiling对11个个体（0-84岁）的DNA样本进行分析，并根据端粒长度进行排序；通过Southern印迹法对相同的DNA进行测量，并将其作为验证。结果显示，Telomere Profiling预测了端粒长度的等级顺序，捕获了Southern印迹的动态范围，并测量端粒随年龄增长而缩短的情况，这对于理解衰老过程中的生物学变化至关重要。此外，Telomere Profiling还确定了端粒长度的第1、第10和第50百分位数。研究团队还将该方法与FlowFISH进行了比较，使用先前诊断为短端粒综合征的特发性肺纤维化（IPF）患者的5μg存档DNA样本进行分析。结果显示，大多数IPF样本的整体端粒长度与FlowFISH测量结果相似，表明Telomere Profiling能够检测出患病个体，有望助力临床诊断和治疗。图2. 纳米孔端粒分析检测端粒长度随年龄的动态变化3.人类端粒具有染色体末端特异性长度和单倍型特异性长度差异为确定人类是否具有染色体末端特异性端粒长度，研究团队分析了来自二倍体HG002细胞系的端粒，从HG002细胞系中分离DNA，并对端粒进行测序，将平均总长度为16.4 kb的reads映射到HG002参考基因组中，共有77个染色体末端通过质量筛选。结果显示，每条染色体的末端表现出不同的端粒长度分布；端粒中位长度为 4.7kb，有66个端粒的长度分布与均值有显著差异，平均长度差异超过6kb。除染色体末端特异性长度外，一些端粒在母系和父系单倍型之间也存在显著差异。上述结果表明，人类端粒具有染色体末端特异性长度分布。图3. 染色体末端特异性端粒长度4.染色体特异性端粒长度在个体间是保守的研究团队将150个个体的端粒序列与最近发布的泛基因组中的亚端粒序列进行了比对，将300个单倍体基因组的全基因组序列与3个高质量单倍体参考T2T基因组CHM13、HG002母基因组和HG002父基因组的序列进行比对，以确定每个参考基因组中相同亚端粒的可重复性。在所有reads中，87%在泛基因组和CHM13中定位到相同的染色体末端，90%在泛基因组和HG002母系中定位到相同的染色体末端，88%在泛基因组和HG002父系中定位到相同的染色体末端。这些数据表明，经Telomere Profiling检测的reads均可映射到一个特定的泛基因组染色体图谱，具有很高的可信度。研究团队建立了相对平均端粒长度，分析了147个个体PBMC样本每个染色体末端端粒长度，并根据端粒的相对长度对染色体末端进行排序。结果显示，17p、20q和12p往往是群体中最短的端粒，而4q、12q和3p往往是最长的端粒。因此，虽然在单个个体中可以看到端粒长度的单倍型特异性差异，但在整个群体中，某些染色体末端更有可能比总体平均值短，而其他染色体末端更有可能比总体平均值长。研究团队还分析了不同年龄段的样本，在婴儿脐带血样本发现了同样的端粒长度差异，说明随着年龄增长，端粒长度普遍缩短，但长度差异保持不变。这些结果表明，个体端粒长度的差异是在出生时就已存在，且在不同个体间是保守的。图4. 染色体特异性端粒长度在人群中是保守的综上所述，研究团队开发了一种简单通用的端粒富集分析方法Telomere Profiling，并跨越了广泛的年龄范围，基于该方法发现了染色体特异性和单倍型特异性的端粒长度分布，其中一些端粒长度之间存在显著差异，拓展了端粒长度的临床意义。综上，Telomere Profiling将帮助人们更深入地了解端粒生物学，并有望推动相关领域发展，从而有望找到治疗疾病的新方法。研究团队指出：“Telomere Profiling可使精确的端粒长度研究广泛应用于实验室、临床和药物发现工作中。因此，在未来的研究中，应该加强不同人群的检测，以证实某些染色体末端是否始终是最短的还是最长的。”原文链接：K. Karimian et al., Human telomere length is chromosome end–specific and conserved across individuals. Science (2024). https://www.science.org/doi/10.1126/science.ado0431

我们都知道在实时定量PCR（qPCR）中，可以通过Cq值和标准曲线得出样本的初始拷贝数。但Cq值与样品中靶标的拷贝数有关，也会受到PCR反应的效率和仪器检测灵敏度的影响。高灵敏度的仪器可以减少检测样品所需的循环数，节省时间并提高效率；同时也可以减少假阴性的存在。Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的设计初衷，就是为了高灵敏高性能而生，每个孔配有单独的激发和发射光纤，可有效提高灵敏度并降低背景噪声干扰（图1左）。此外跟同类产品相比，Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统使用全孔检测技术，每个孔可采集约100,000个数据点，使每个qPCR扩增曲线能够准确、可重复和灵敏地表示荧光强度，从而提高荧光数据的可靠性（图1右）。▲ 图1. 高性能光路系统为了进一步表明Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的灵敏度，与同类产品进行了以下比较实验：使用酵母的三个RNA靶标进行检测，分别是高丰度的Actin基因、低丰度的6Y’端粒基因，以及单拷贝的TEL06R端粒基因。材料和方法从10mL酵母培养液中制备出RNA，将3µg RNA逆转录成cDNA作为模板备用。对于Actin，在Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统上使用的cDNA按1：20稀释；其他的cDNA均按1：10进行稀释。引物如下：▲ 表1. Actin、6Y’端粒基因和TEL06R端粒基因的引物对采用4个4倍系列稀释的cDNA模板和一个无模板对照来计算qPCR扩增效率，反应体系和扩增程序如下：结果和讨论在高丰度Actin和低丰度6Y’端粒基因的检测中，Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统和同类产品的扩增效率非常相似（表2）。然而，在单拷贝TEL06R端粒基因的检测中，发现同类产品得到的Cq值偏大，位于35-38之间，导致计算出的扩增效率大于200%，不能作为参考数据；AzureCielo™ 实时荧光定量PCR系统则计算得出E=96%（表2）。▲ 表2. 各基因的扩增效率及R2值同时结果表明，尽管Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的Actin cDNA上样量仅为同类产品的一半，但Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统的Cq值小于同类产品的Cq值，两者相差0.65（表3）。针对低丰度的6Y’端粒基因和单拷贝的TEL06R端粒基因，两者的Cq值差异较大，差值分别是2.25和4.02（表3）。这些结果表明，随着基因起始拷贝数的减少，Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统灵敏度的提高变得尤为重要。▲ 表3. 各基因的数据对比灵敏度也会直接影响数据的准确度和再现性。随着PCR循环数的增加，非特异性产物或引物二聚体扩增的可能性也增加。尤其是使用非特异性荧光染料（如SYBR green）检测PCR产物时，更需要避免过多的循环数。因此，在早期循环中检测扩增的能力大大提高了数据的可靠性。具有单孔检测的Azure Cielo™ 实时荧光定量PCR系统设计用于最小化背景噪声和最大化灵敏度，以实现qPCR反应中最高的特异性和精确度。快快申请试用，让它帮助你优化qPCR实验吧。