核酸浓度检测

ctDNA全称为circulating-tumor DNA，是指人血液中肿瘤细胞体细胞DNA经脱落或者当细胞凋亡后释放进入循环系统，故被称为循环肿瘤DNA，包含着癌症早期诊断和预后监测等重要信息。然而，ctDNA的精准检测面临着三大问题：临床样本（如血液、尿液、粪便）等成分复杂；ctDNA的半衰期较短（传统ctDNA富集和纯化通常是基于磁珠和二氧化硅膜，然而，当处理大量样品时，这些技术难以实现快速、高效的富集，并且操作复杂，检测灵敏度有限。因此，迫切需要一种创新的ctDNA富集与分析技术，以提高临床诊断的灵敏度。近日，北京航空航天大学王杨、常凌乾、樊瑜波，上海感染与免疫科技创新中心徐高连等在 ACS Nano 期刊上发表了题为：An ion concentration polarization micro-platform for efficient enrichment and analysis of ctDNA 的研究论文。该研究开发了一种基于离子浓度极化的微平台，能够在30秒内从血清、尿液和粪便等各种临床样品中，快速、高效地富集和纯化ctDNA。并集成了等温扩增模块，将ctDNA的检测灵敏度提高了100倍，显著消除了因ctDNA丰度低而导致的样本假阴性结果。离子浓度极化（ICP）是一种新兴的原位分子富集和纯化方法，在阳离子选择性的Nafion膜上施加垂直电场，根据带电分子的电渗透力和电泳力进行分离和纯化。同时结合“自由流动”的概念，形成基于“自由流动ICP（FF-ICP）”的连续分离方法。对于带有负电荷的核酸分子，受到向下的电渗透力（EO）和不断增加的向上的电泳力（EP）的共同作用，被电动力学捕获，形成离子富集区。同时，施加连续的水平驱动力，使被富集到的核酸或蛋白分子水平推进并收集，从而进行后续的扩增分析（图1）。图1. “自由流动ICP”的原理图基于FF-ICP的DNA富集策略，研究团队设计了一种自供电、集成的微流控芯片，用于高灵敏度的核酸检测。微平台有两个功能区：核酸富集区、核酸等温扩增检测区（图2a）。两个区域由一个“y形”提取通道连接。富集区内固定了阳离子选择性的Nafion膜。在垂直电场和水平驱动力作用下，液体样品中的核酸被富集，形成“阴离子流”，然后在“y”形提取通道处收集（图2b）。随后，“阴离子流”进入检测区，经等温扩增后进行定量分析（图2c）。剩余的溶液收集在废液池中（图2d）。富集后的核酸进入到核酸扩增区之后，在含有100个微孔的检测区，用LAMP法进行等温扩增（65℃）。采用阳性微孔总数和每个微孔的荧光强度作为双参数指示，使分析更加准确和稳定。为了给FF-ICP提供稳定的水平驱动力，团队在生物芯片中集成了一个自供电真空电池系统，电池使用预脱气的PDMS，通过液体通道和真空通道之间的气体交换提供“电力”，从而推动液体样品流动（图2e）。使得整个平台能够在不需要外部泵的情况下，连续地向下游输送和富集核酸分子，并进行核酸扩增，具有用户友好的性能。图2. 基于FF-ICP的集成微平台用于连续的核酸富集和扩增利用微平台检测临床患者血清中的ctDNA。与未处理样品相比，该装置的富集效果和纯化能力明显高于试剂盒（图3a-3c）。同时，最终的扩增结果也显示，该微平台能够达到100拷贝/mL的灵敏度，比传统方法（基于二氧化硅/磁珠的DNA提取与PCR扩增）提高了100倍（图3d）。在临床应用中，对北京大学肿瘤医院提供的38例非小细胞肺癌患者的血清样本进行EGFR外显子19缺失突变的检测。结果表明，微平台的灵敏度显著高于传统PCR技术，达到了100%，能够大大避免了因ctDNA浓度不足而造成误诊的风险（图3e和3f）。此外，该装置检测到的早期患者血清中ctDNA的含量明显低于中晚期患者，证明该平台的定量判断能力可以预测患者的肿瘤发展（图3g和3h）。通过将分析物的提取和富集（FF-ICP）与进一步的生物分析技术进行无缝集成，为超低丰度生物标志物的检测带来巨大的好处。与传统检测技术相比，该平台的灵敏度显著提高了两个数量级，能够避免因浓度不足导致的误诊风险，尤其有利于临床感染筛查或者早期肿瘤诊断。图3. 用FF-ICP装置检测血清中ctDNA该研究第一单位为北航生物与医学工程学院和生物医学工程高精尖创新中心。通讯作者包括北航生物与医学工程学院常凌乾教授、樊瑜波教授、王杨副教授、上海感染与免疫科技创新中心徐高连研究员。核心作者包括北航博士生王之莹（第一作者）、硕士生刘明（共一）、北京大学肿瘤医院吴楠教授、北京大学第三医院林成浩主任（共一）等。

目前，临床上针对新型冠状病毒的实验室检测主要是SARS-CoV-2病毒核酸和血清特异性抗体检测。核酸检测，是指通过特殊的技术手段检测临床样本中是否存在特定的病原体核酸，从而诊断患者的感染原因。此次新冠病毒是单链RNA病毒，根据《新冠病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第七版）》（下文简称诊疗方案）建议，针对疑似病例的确诊，需要具备以下病原学证据之一者，即为确诊病例：1. 实时荧光RT-PCR检测新型冠状病毒核酸阳性；2. 病毒基因测序，与已知的新型冠状病毒高度同源；3. 血清新型冠状病毒特异性IgM抗体和IgG抗体阳性；血 清新型冠状毒特异性IgG抗体由阴性转为阳性或恢复期较急性期4倍及以上升高。诊疗方案中提到了三种检测方式，其中实时荧光RT-PCR和基因测序都属于核酸检测，需要进行核酸提取。新冠病毒核酸检测是临床诊断的“金标准”， 患者鼻咽拭子、痰、纤维支气管镜灌洗液、血液、肛门拭子、粪便等标本核酸检测阳性，说明其感染了新冠病毒，而且具有传染性。目前新冠病毒检测中核酸提取一般通常使用两种方式：手工提取和仪器提取。病毒核酸提取试剂盒采用具有独特分离作用的磁珠和缓冲液系统，专为快速、高度敏感,有效的从血清、鼻咽拭子样本中提取病毒DNA、RNA而研制，磁珠在一定条件下对核酸具有很强的亲和力，并且在条件改变时，磁珠与其吸附的核酸分离，能够达到快速分离纯化核酸的目的，产品提取出的核酸能够满足下游各种分子生物学实验检测，例如PCR扩增等。荧光定量PCR是临床分子检测中常用的检测方法，病毒核酸提取方法的选择对于最终的检测结果的影响非常重要。在以往采用RT-PCR对病毒核酸进行的检测中，磁珠法是较为常用的核酸提取方法，普遍认为其对病原体的核酸提取具有简便、高效、提取浓度及纯度较高等优势。此外因各实验室条件不同及针对的病毒的试剂盒不同，离心柱法、煮沸裂解法等也在临床大量应用。不同的病毒核酸提取方法因其提取产物浓度、纯度的差别以及对RNA的保护程度不同，将在一定程度上影响病毒核酸尤其是临界阳性样本的核酸检出。磁珠法手工提取病毒核酸主要设备有：冰箱、超低温冰箱、高速冷冻离心机、混匀器、微量加样器(0.2-1000ul)、磁力架、无菌无酶吸头、移动紫外灯、水浴锅或金属浴、生物安全柜等。无菌无酶吸头系列磁力架（货号DTCLJ-20）核酸提取仪病毒核酸医院检验科在进行新冠病毒检测时通常面临着大量的待检测样本需要短时间出来完成报告结果，因此自动化、高通量的核酸提取仪已经变得极为迫切。LunAmple全自动核酸提取纯化仪高通量提取 ---- 每次提取可根据需要选择1-72个样本人性化界面 ---- 触屏加按键式直接操作，无需连接电脑简单易用自由编辑 ---- 可自行编辑所需程序或预设保存，快速便捷结果稳定 ---- 提取灵敏度高，重复性好，核酸质量高安全可靠 ---- 配备紫外灭菌功能，减少与有害试剂的接触防止污染 ----内置独家去除核酸气溶胶装置，保护样本不被污染核酸提取制备的整体步骤

点击此处可了解更多详情→超微量分光光度计 超微量分光光度计是一种高精度的分析仪器，主要用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量检测。它利用分光光度的原理，可以将样品中的物质进行分离和检测，以获得其具体的浓度和组成等信息。 超微量分光光度计具有很多优点，比如说它的测量精度非常高，可以检测出样品的微小差异；它的灵敏度也很高，可以检测出样品中微量的物质；此外，它还可以同时对多个样品进行检测，大大提高了工作效率。这些优点使超微量分光光度计成为生物医学、化学分析等领域中必不可少的实验仪器之一。 在使用超微量分光光度计的过程中，需要注意以下几点。 首先，要保证仪器的稳定性，避免在测量过程中出现误差；其次，要注意样品的准备，要将样品进行精细的稀释和纯化，以保证测量结果的可靠性；最后，要根据不同的样品选择合适的波长和测试条件，以便得到更准确的结果。 总的来说，超微量分光光度计是一种功能强大的实验仪器，它的应用范围广泛，可以用于核酸、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量检测。它不仅可以提高实验的精度和效率，还可以为生物医学、化学分析等领域的研究提供有力的支持。