核酸检测原理

近日，青岛科技大学海洋学院马翠萍教授团队在病原体RNA快速检测、提高核酸检测特异性领域取得新进展。相关成果以“Engineering of a chimeric template triggers RNase H-based isothermal amplification approach for sensitive detection of pathogen RNA”和“Boron nitridenanoplate-based improvement of the specificity and sensitivity in loop-mediated isothermal amplification for Vibrio parahaemolyticus detection”为题目分别发表在国际知名期刊《AnalyticalChemistry》（中科院一区Top）（doi.org/10.1021/acs.analchem.3c04098）和《Analytica Chimica Acta》（中科院一区Top）（doi.org/10.1016/j.aca.2023.341851）上。 论文第一作者分别为海洋学院第五层次引进人才李勇副教授和研究生张鑫，以及研究生蔺硕，两项成果通讯作者均为马翠萍教授，青岛科技大学为第一单位和唯一通讯单位。病原体的准确检测对于临床诊断和生物医学研究具有重大的意义，基于DNA检测聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）技术作为病原体检测的金标准，具有高灵敏、高特异性的优点，但存在无法区分病原体生存状态的问题；相比之下，RNA具有半衰期短、丰度高的特点，基于RNA的检测可以选择性地检出具有转录活性的病原体。针对病原菌的高灵敏、快速检测问题，马翠萍教授团队构建出一种新型等温RNA检测技术，该技术基于DNA/RNA嵌合探针触发指数扩增反应，检测结果可以通过便携式紫外灯即可进行判读，且无需精密的温度控制装置（图1）。另外，该技术可以实现靶标RNA区域的短期保护，即使在RNA酶存在的条件下，该技术至少可以保证36小时内RNA不会发生降解，避免了由于靶标降解造成的假阴性问题。该平台对于大肠杆菌RNA的检测限为1fg/μL,对于牛奶中大肠杆菌的检测限为1.0×102CFU/mL，检测过程40分钟之内即可完成，不依赖于复杂的检测设备，有望成为临床诊断和食品安全检测领域强有力的RNA检测工具。图1 基于RNaseH的等温指数扩增方法示意图此外，以DNA扩增为基础的核酸检测已广泛用于分子诊断、食品安全监测和传染病预防。然而，引物二聚体的形成、发夹结构和错配杂交导致的非特异性扩增严重限制核酸检测技术的实际应用。因此，迫切需要探索一种提高核酸检测的特异性和灵敏度的方法。马翠萍教授团队证明了纳米材料氮化硼纳米片（Boron Nitride Nanoplate, BNNP)，由于其独特的表面性质，可以与扩增反应的主要组分，如单链引物和BstDNA聚合酶相互作用，并提高溶液的导热性，BNNP的存在显著提高了PCR和环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal Amplification, LAMP）的特异性（图2）。此外，BNNP还提高了LAMP的灵敏度，并且基于BNNP的LAMP的检出限比传统LAMP低两个数量级，同时此方法被证实可用于海产品中副溶血性弧菌的检测。这是首次系统地证明BNNP可以提高PCR和LAMP扩增反应的效率和准确度，从而极大地扩展了核酸检测在实验室和现场环境中的应用。图2 BNNP提高核酸扩增方法特异性和灵敏度的原理图

数字PCR技术具备不依赖于标准品、灵敏度高、抑制剂耐受力高以及可区分微小差异等技术特性，是能够直接对目标核酸进行绝对定量的有力检测工具。数字PCR技术在液态活检、产前诊断、病原体筛查、转基因动植物、遗传育种、环境监测方面都有广泛的应用。此外，在细胞治疗及基因治疗等先进治疗领域还能够实现对核酸标准品及质控品定值、病毒基因组（如rAAV VG）滴度测定、GOI拷贝数检测、残留检测以及外源污染物等的检测。新一代微滴芯片数字PCR技术，集微滴式和芯片式数字PCR优势于一体，能够实现自动微滴体积质控和智能可视化数据分析，一步操作，双倍效能，为核酸绝对定量提供可靠的检测工具。本期我们邀请法国Stilla数字PCR系统应用专家王琳琳老师，为大家介绍数字PCR的技术原理、技术优势以及前沿应用。直播时间：2022年5月26日下午3：00主要内容：1、数字PCR如何实现核酸绝对定量2、数字PCR的技术特点和应用优势3、数字PCR在工业CGT等领域的应用进展主讲人：王琳琳，法国Stilla naica微滴芯片数字PCR系统应用专家。毕业于四川大学，细胞生物学专业，从事数字PCR技术数年，在数字PCR技术原理、应用以及方法学验证方面具有丰富的经验。 扫描下方海报内二维码报名

近日，河北、北京、辽宁及黑龙江等局地新冠疫情的爆发引起全国关注。河北医护人员在3天内完成1025万人员的新冠筛查，这其中的坚辛自是难以言表。新冠核酸检测之生物安全在致敬这些医护工作者时，新闻报道中凸显的生物安全问题也引起业内关注。新冠病毒相比流感及非典，传染性更强。近日在英国、南非、巴西等地发现的变异新冠病毒也被证实传染性增强。因此，新冠核酸检测时的生物安全一直备受关注。基于已有的法规政策，新冠疫情爆发后，我国又相继出台一系列政策及指南，保障医护人员安全。Ø 2019新型冠状病毒相关实验室检测的生物安全指南（试行第一版）Ø 新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）Ø 医疗机构内新型冠状病毒感染预防与控制技术指南（第一版）Ø 医疗机构新型冠状病毒核酸检测工作手册（试行第二版）Ø 医学生物安全二级实验室建筑技术标准（T/CECS 662 2020）Ø … … 以上文件对新冠核酸检测中的样本采集及运输、核酸检测及废弃物处理等环节，涉及到的人员、设备、试剂、方法、环境及防护物资等方面进行了详尽的论述。天隆智造，安全保障力Max！天隆科技专注核酸检测、分子诊断领域多年，一直致力于核酸检测仪器及试剂的研发、生产和销售，已取得50余个国内NMPA注册及备案，30余个欧盟CE、美国、德国及韩国等海外注册及认证。产品型号多样、性能卓越、设计人性，尤其是在生物安全防控方面拥有多种措施，可在核酸检测全程守护医护人员安全。1、采样环节天隆新冠采样套装采用自主研发的特制专用配方，采样后可及时灭活病毒，并避免样本降解。既能保障人员安全，又可保证结果精准。此外，天隆采样管可直接适配天隆全自动核酸工作站或全自动样品处理系统，无需用户再手工转管，开盖/闭盖或加样。其中，全自动样品处理系统可使用平板电脑或手机远程WiFi操控，实现样本-人员“0”接触，有效降低人员感染风险。2、核酸提取环节磁珠法核酸提取技术由于自动化程度高、样本通量大、产物浓度和纯度好，尤其是安全性高，已成为业内主流方法。天隆科技全自动核酸提取系统采用磁珠法原理，操作自动化，减少人员接触，并使用深孔板耗材，可避免交叉污染。其中，GeneRotex 96/48/24及PANA9600S等系列产品在国内首家采用旋转混匀的提取方式，气溶胶产生风险更低，并申请发明专利（专利号：ZL 201710435931.8）。此外，天隆产品还拥有紫外消毒、空气过滤、实验分区、液滴捕获、远程Wifi操控等多种防污染措施，全方位保障医护人员安全！3、核酸检测环节天隆核酸检测系统采用荧光PCR法，全程闭管检测，并在反应体系内添加UNG酶防污染，结果可靠，可全面保障人员安全。4、实验室建设天隆科技致力于新冠核酸检测整体方案的提供，除了相关仪器试剂，天隆科技还提供多样化PCR实验室方案，完全满足加强P2型实验室国家标准及行业指南。目前已为近千家医疗机构及疾控中心提供实验室建设服务，全国100家公共检测实验室占比高达84%。新冠抗疫，医护人员是主力，而天隆智造就是你们坚实的后盾，我们用匠心全程护您周全！