地区医学检测

可冻干的分子酶和预混液新冠疫情使得“核酸检测”家喻户晓，PCR检测作为金标准承担了无限重任。然而由于PCR是变温过程，对实验环境、仪器设备等有严格要求，具有一定的局限性，偏远地区、县级医院开展核酸检测非常不方便。恒温扩增技术由于其扩增期间反应条件温和、不需要特殊的仪器设备，能真正意义上实现分子POCT而更受瞩目。什么是IPA（RPA）？IPA（RPA）技术是在常温恒温条件下聚合酶介导的核酸快速扩增技术，在恒温条件下（39-42℃），特异性引物与重组酶形成的复合物结合DNA并沿着DNA链寻找引物的结合位点，完成定位后发生链交换反应并打开DNA双链间的氢键，单链结合蛋白（SSB）与单链DNA结合，阻止形成双链，之后DNA聚合酶从发生链交换的位置进行快速核酸扩增反应。图片来源于网络国盛医学IPA（RPA）技术优势国盛医学开发的性能领先的核酸快速扩增技术IPA（Isothermal Polymerase Amplification）可提供恒温扩增的整体解决方案，包含各类预混液试剂产品方案及完备的分子酶精制原料，助力新一代精准分子诊断快检方案的研发。

肿瘤的液体活检主要包括循环肿瘤DNA（ctDNA）、游离肿瘤细胞（CTC）及外泌体（exosome）。众多研究表明三者与肿瘤的早诊、治疗、预后等均存在相关性。目前在临床应用最多的当属ctDNA检测。正常人的体液内亦存在来自于机体正常细胞的游离DNA，简称循环游离DNA或cfDNA；在肿瘤患者体内，循环游离DNA不仅仅来自于正常细胞，还有一部分来自于肿瘤细胞，即ctDNA，也是循环游离DNA的一部分，因此我们可以通过检测ctDNA相关变异状态作为来自肿瘤细胞的标志物。目前临床肿瘤ctDNA检测最常见的应用领域为治疗方案选择及耐药监测。 由于ctDNA具有片段化程度高、丰度低等特点，其主流检测方法包括Cobas法、Super-ARMS法、高通量二代测序（NGS）及数字PCR。液体活检的运用与优势液体活检最大的优势在于微创、快捷，易于动态监测；一定程度上全面反映肿瘤整体变异状态，不受肿瘤异质性影响；适用人群更广泛，对于难以取得活检肿瘤组织或取得肿瘤组织不够基因检测的患者，液体活检提供了一个了解肿瘤基因变异状态的有效途径。1. 早期诊断肿瘤的早期诊断最大难点是由于肿瘤负荷很低，可能影像学上没有明确的病灶，此时血液中ctDNA的含量亦极低，普通针对ctDNA突变的检测难以满足早诊的要求。但DNA甲基化改变是贯穿整个恶性转化的表观遗传学改变。即使在肿瘤发展的最早期，DNA甲基化模式也已经与正常细胞存在显著差异；其次，甲基化水平的改变是具有组织特异性的，即对甲基化进行检测及比对，能够进行器官溯源，发现到底是哪里可能会发生或已经发生了肿瘤。 因此，对ctDNA的甲基化水平进行检测，是一种有效的肿瘤早期筛查辅助手段。比如SEPT9基因甲基化检测试剂盒对结直肠癌诊断的敏感度及特异性可达74.8%及97.5%[1]，现在已经可以作为一种结肠镜前的初筛手段。2. 指导靶向治疗肿瘤的靶向治疗是目前临床最常见的ctDNA检测应用。根据《非小细胞肺癌血液EGFR基因突变检测中国专家共识》，如果有肿瘤组织，推荐使用肿瘤组织进行驱动基因检测；若无肿瘤组织样本或肿瘤组织样本不足的情况下，液体活检可作为很多患者基因检测的首选。无论何种检测方式，应注意的是若组织活检或者液体活检有任何一个是阳性，患者应当考虑使用靶向药物；当液体活检先行的时候，若液体活检为阴性，应提示患者可能存在假阴性，必要时再取活检，以避免错失可能的靶向治疗机会。 3. 耐药监测靶向治疗终归面临耐药的问题，而液体活检由于微创快捷的优势，是理想的耐药监测材料。对于EGFR一代或者二代TKI用药人群，约半数以上的患者出现EGFR 20号外显子T790M而耐药，因此对于此类患者的耐药监测可使用敏感度高且成本低的数字PCR法对T790M单点进行监测。如果患者已经出现了耐药，亟需探索其耐药机制以更换治疗方案，此时推荐使用NGS对基因变异的整体状态进行检测，以便全面寻找耐药原因。4. 预后评估在预后评估方面，微小残留病变（MRD）是目前研究的热点。MRD指的是治疗后传统影像学和实验室方法无法发现，但通过分子诊断可以发现的肿瘤来源的分子异常。多种肿瘤的相关研究表明，ctDNA突变状态可提示接受根治性治疗的患者的预后复发，并且已经在部分临床实验中得到应用。液体活检的样本采集要求血液的规范化处理是保证液体活检结果准确的基本前提。在血液样本的送检方面应注意：1.采血管的选择ctDNA检测的血液需使用EDTA抗凝管或者cfDNA专用采血管。若使用EDTA抗凝管，血液离体后应尽量保存于4℃，2小时内需尽快进行血浆分离；若使用cfDNA专用采血管，血液可在常温保存3-5天。切记严禁使用肝素抗凝管，因为肝素在后续DNA提取过程中难以去除，并且会抑制PCR反应，导致后续ctDNA检测失败。2.采血量及采血注意事项一般而言，ctDNA检测需要采集8-10ml的全血。采血后严禁剧烈震荡血液，或者使用注射器针头对血液进行转移，因为这样的操作均会导致血液中细胞破裂，从而造成基因组DNA的污染，增加ctDNA检测的假阴性。采血后应轻柔将采血管颠倒8-10次进行混匀。3. 患者采血时间的选择一般建议患者空腹进行抽血，特别是血脂较高的患者。这是由于低密度脂蛋白对荧光有屏蔽和吸收的作用，会干扰后续ctDNA的相关检测；三酰甘油会降低ctDNA的提取率；若使用微滴式数字PCR检测技术，血液中的脂质会影响后续微滴的生成。此外，对于正在进行化疗的患者，一般建议患者化疗结束后进行抽血。 国盛医学分子保鲜系列产品血液样本的保存及运输作为液体活检中一个重要的环节，如何收集保存全血样品中游离cf-DNA和cf-RNA的呢？游国盛医学研发的游离DNA采血管和游离RNA采血管可以满足液体活检中样本保存和运输的需求。 游离DNA采血管 国盛医学游离DNA采血管含有独特的抗凝剂和保鲜试剂，不含干扰游离DNA提取和抑制PCR成分，能稳定有核细胞，防止释放细胞基因组DNA而污染目标游离DNA；抑制核酸酶降解游离DNA，可在常温下稳定运输保存7天以上。 游离RNA采血管 国盛医学游离RNA保存管能稳定血细胞并防止血液凝固，防止血液有核细胞中基因组DNA和RNA的释放；能够有效抑制血浆中的核酸酶，防止游离RNA在体外降解；适合常温运输，储存样本5天及以上。

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