质谱检测分子量

质谱仪器作为一种质量检测仪器，被应用到各个学科领域中，尤其是在化学化工、环境能源、医药、生命及材料科学等领域发挥着重要作用。在常规质谱分析中，被分析物质首先被离子化，随后各种离子被引入真空中的质量分析器，在分析器中的电场或磁场作用下，离子的运动特性随其质荷比不同而产生差异，因而造成时空上的分离，并由检测器依次检测出来。而在这种原理下，质谱仪测量的是离子的质荷比（m/z)，而不是质量本身。利用质谱仪器对样品的分析过程中，样品的雾化过程十分关键。目前，常用的电喷雾技术原理是由John Fenn提出的电喷雾电离（ESI）技术，这一理论也获得了2002年的诺贝尔化学奖。通常对蛋白质这种大分子来说，ESI质谱中都会呈现多种价态的谱峰群，群落中的每一组为某个电荷态该蛋白质的各个同位素峰、盐峰以及加合物峰等。由于电荷态z通常是连续的整数分布（例如z = 11，12....21,22...)，人们可以通过计算不同电荷数对应的群落m/z的间隔来推算各组的电荷数z，进而求出实际的质量m的分布，也可以使用软件进行解卷积得到m分布。这种分析手段对于分析分子量较小（分子量在5万以下）、简单纯净的蛋白样品还是很有效的。然而，在实际应用中对天然蛋白和病毒颗粒的分析却不那么简单。随着分子量上升，分子结构越来越复杂，各种翻译后修饰使被测蛋白的分子量出现差异化，很宽的质量分布（可达上千Da）使得不同价态的峰群连接在一起。如图1所示，这种缺少电荷状态以及同位素峰的“死亡驼峰”，我们很难通过解卷积的形式进行分析。并且，对于很多糖蛋白，分子量超过3、4万就出现峰群交叠，无法用解卷积软件来获得分子量的分布信息。因此，对于大生物分子的质谱分析，仅靠提高仪器的分辨率是无济于事的。在这种情况下，电荷检测质谱（CDMS）技术便成为了我们的“救命稻草”。电荷检测质谱（CDMS）通过同时测量单个离子的质荷比和电荷数，进而计算获得离子质量m。因此，相较于其他类型质谱，CDMS技术的关键是如何准确地测量单个离子的电荷。目前，电荷检测质谱技术还没有现成的商品化仪器，只有能够自己开发质谱仪器硬件，或自己改编FTMS软件的专家才能进行这样的实验。而在今年的ASMS会议上，赛默飞公司重磅推出了直接分析质谱技术（DMT），并将其结合在了Orbitrap上，这使得超大分子量的复杂蛋白的直接质谱检测成为了可能。直接分析质谱技术其原理是：在Orbitrap中检测来自离子沿中心电极的中心轴旋转的轴向频率，进而确定离子的m/z信息；与此同时，来自外电极上的感应电荷振幅也会被检测，从而确定离子的电荷z的信息。直接分析质谱技术模式为 Orbitrap 质量分析仪增加了电荷检测功能，能够同时测量数百个单个离子的质荷比 (m/z) 和电荷数 (z)。这使得 Orbitrap 质量分析仪可以直接计算分析物的质量，而不需要根据 m/z 去卷积。根据 m/z 去卷积的方法依赖于测量结果中已分辨的电荷状态和/或同位素分辨的信号。直接分析质谱技术模式提高了分辨率，并且扩展了动态范围，提高了可获得的质量测量结果的上限，同时由于单个离子测量的灵敏度较高，可以从浓度明显较低的样品中采集到更有价值的数据。

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 自质谱成像技术于二十世纪80年代前半期诞生以来，至今为止不断持续着技术改革，并被广泛运用于以新药研究和代谢产物研究领域为首的众多领域中。如今仍以提升灵敏度和空间分辨率、重现性等为目标，不断进行着技术改良。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 同时，也开发出多种离子化所需的基质，如何从这些基质中选出适用于检测目标化合物的基质成为重点。 span style=" text-indent: 2em " 除基质选择外，其涂布方法也会对分析结果造成很大影响，因此，现有多个应用于检测目标化合物的基质涂布方法正在研究中。大致可分为喷雾法和升华法两种方法，两种涂布方法均有自己的优缺点，现阶段经常会同时使用两种方法。本公司开发了能控制基质膜厚的基质升华涂布装置iMLayer（图1），对涂布方法进行研究。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 我们针对以往难以重结晶的基质9AA，开发了升华后重结晶的方法，并在此进行报告。此外，还将对小鼠肝脏中低分子量代谢产物的MS成像结果示例进行介绍。 /p p style=" text-align: right text-indent: 2em line-height: 1.75em " ——R.Yamaguchi, E.Matsuo, T.Yamamoto /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 1、不同基质涂布方法对MS成像分析造成的影响 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 基质涂布方法对基质的结晶形成和MS成像分析造成的影响如表1所示。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 与升华法相比，通过喷雾法生成的基质的结晶较粗，并可能因样本中所含成分的渗漏导致空间分辨率降低。均匀性较差，基质溶液干燥后结晶时会依赖湿度和温度等周围环境，因此重现性也会变差。另一方面，样本中所含化合物的提取效果较好，可能提高检测灵敏度。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 相比之下，升华法具有结晶较细、难以渗漏、均匀性好、重现性良好的特点，是高空间分辨率成像所不可或缺的方法。但相对的，其样本中成分的提取效果不佳，在灵敏度上可能存在不利的一面。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 实际的测量灵敏度依赖于检测化合物的结构。例如，在分析磷脂质等时，采用升华法便具有足够的灵敏度，诸如胺碘酮等药物可以足够的灵敏度完成MS成像（参考应用文集B61）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 另一方面，在检测小鼠肝脏等器官中含有的ADP 和ATP 等低分子量代谢产物时，通过升华法进行基质涂布，由于没有任何提取效果，无法得到足够的灵敏度。因此，绝大多数例子都是通过喷雾法涂布9AA来实施MS成像，但其空间分辨率相对较低。于是，我们对将DHB和CHCA上使用的升华后重结晶法涂布9AA所需的条件进行了研究。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/0178e2f4-5edd-42fd-ab37-3b27f1e3173b.jpg" title=" 微信截图_20200619165723.png" alt=" 微信截图_20200619165723.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 图1 基质升华装置iMLayer /p p style=" text-align: center " 表1 基质涂布方法对结晶形成和MS成像分析造成的影响 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/962223c2-c637-4894-9498-e953c6d6b688.jpg" title=" 2.png" alt=" 2.png" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 2、基质升华后重结晶法 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 对9AA进行升华后重结晶。如图2所示，将含有5%甲醇的滤纸和升华处理后的样本放入相同容器中，于37℃的恒温环境下静置5分钟。此时，滤纸中的5%甲醇蒸发，渗入样本中，在提取样本中化合物的同时会使少许9AA结晶溶解。之后将其真空干燥器内干燥10分钟，使溶解的9AA进行重结晶。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/b1b946ad-81b9-4670-bd42-0b2b1b03f739.jpg" title=" 33333333333333.png" alt=" 33333333333333.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 图2 9AA升华后重结晶的方法 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/8767d240-e8eb-44fc-8470-cff5822571a1.jpg" title=" 444444444.png" alt=" 444444444.png" / /p p style=" text-align: center " 图3 成像质谱显微镜iMScopeTRIO /p p style=" text-align: center " 表2 iMScope i TRIO /i 测量参数 /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/69636f83-0667-4f8a-a02b-4d1c757bc977.jpg" title=" 55555555555.png" alt=" 55555555555.png" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 3、使用升华后重结晶法提高MS成像灵敏度 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 对9AA升华后重结晶的小鼠肝脏样本，使用成像质谱显微镜iMScope& nbsp i TRIO /i （图3），根据表2的参数进行质谱成像分析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 对比升华法进行基质涂布样本与升华后重结晶样本的分析结果、比较其分析区域的平均质谱图（图4）。仅采用升华法时、能强烈检测到基质9AA的峰（m/z 385.14）（图4▼），基本上检测不到低分子量代谢产物的峰，但通过实施升华后重结晶，使来自低分子量代谢产物的峰强度增加（图4▼等），确认其提升检测灵敏度的效果。此外，其他多个低分子量代谢产物的MS图像，通过升华后重结晶的处理，能够获得更为清晰的MS图像（图5）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 针对难以重结晶的9AA开发的升华后重结晶方法，充分利用升华法的优势成功实现了无损且高灵敏度的MS成像分析。 /p p span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/0bbf3127-6052-4b6a-af7e-a0c6fc57f542.jpg" title=" 6.png" alt=" 6.png" / /p p style=" text-align: center " 图4 质谱图（升华法和升华后重结晶法的比较） /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/de208828-8702-40d6-8202-037e64b3f190.jpg" title=" 7.png" alt=" 7.png" / /p p style=" text-align: center " 图5 MS图像（升华法和升华后重结晶法的比较） /p p br/ /p

导读随着生物医药技术的发展，越来越多的生物药陆续上市，如治疗慢性疾病的寡核苷酸药物Leqvio，“一年只需注射两针”就可以长效持久的降低血液中胆固醇含量，以及用于治疗II型糖尿病的多肽类药物Mounjaro。在寡核苷酸和多肽药物的质量控制中，分子量测定是定性表征中不可缺少的一部分，而单四极杆液质联用仪（LCMS）是测定分子量的利器。但与小分子药物相比，多肽和寡核苷酸药物极性和分子量均较大，在LCMS中带多电荷，所以分子量测定时可能会存在分子量测定范围窄、灵敏度低等问题。小身材大智慧 LCMS-2050岛津最新款单四极杆质谱仪LCMS-2050兼顾小型化和高性能，其离子源为加热型ESI/APCI（DUIS）源，使得寡核苷酸和多肽药物等分子量较大的极性化合物更容易电离，所以LCMS-2050具有分析灵敏度高，分子量测定范围广的特点。此外，岛津LabSolutions软件自带分子量解卷积功能，可以快速对多电荷质谱图进行解卷积，获得分子量相关信息。分子量测定案例分享寡核苷酸药物本方案中寡核苷酸药物为小干扰核苷酸（siRNA），是一类双链RNA分子（正义链和反义链），长度为20-25个碱基对。通过流动相的调整和质谱参数的优化，LCMS-2050（负模式）检测得到了siRNA多电荷质谱图，质荷比为600~1700。此时质谱图中无其他加和离子干扰，且高质荷比也有明显响应。通过岛津LabSolutions软件自带的多电荷解卷积功能，计算得到siRNA正义链电荷数量为4~11，分子量为6631.64 Da，反义链电荷数量为4~10，分子量为6637.66 Da，与理论值的偏差均小于0.4 Da。siRNA色谱图正义链质谱图正义链分子量解卷积结果反义链质谱图反义链分子量解卷积结果多肽药物此多肽药物为一种生长抑素，其理论分子量为1637. 72 Da。LCMS-2050（正模式）检测得到质荷比为546.76~1638.47，通过LabSolutions解卷积功能计算得到分子量为1637.45 Da，与理论值偏差为0.27 Da。多肽药物色谱图多肽药物质谱图多肽药物分子量解卷积结果结语岛津最新款单四极杆质谱仪LCMS-2050兼顾小型化与高性能，适用于多肽、寡核苷酸等化合物分子量测定，具有灵敏度高、分子量测定范围广的优势。了解更多详情，敬请下载《LCMS测定小干扰核苷酸siRNA分子量》《LCMS-2050在多肽分子量定性分析检测中的应用》本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。