微量脂质体挤出器

马尔文仪器公司的高级应用科学家Pauline Carnell和技术支持经理Mike Kazsuba探讨了纳米颗粒跟踪分析技术以及光散射技术在表征脂质体作为药物载体中的应用及效果。 　　脂质体是一种重要的给药载体，已获批用于多种治疗配方。脂质体由磷脂质组成，具有单层或多层结构，拥有亲水内层和疏水外层，可制成不同大小的颗粒。这些颗粒可进行生物降解，基本无毒。最为重要的是，它既能封装亲水物质，又能封装疏水物质。此外，通过修饰脂质体表面，还可对特定生理部位进行靶向给药，延长脂质体在体内的留存时间，并可用于设计诊断工具。 　　正如其他类似的研究，应用脂质体的关键在于确保其物理特性与用途相符。例如，脂质体进入人体后会如何反应?脂质体是否足够稳定从而保证靶向性?粒度是否适合临床应用，或者是否会在血液循环中消失? 　　了解脂质体制剂的粒度、浓度和zeta电位能帮助人们预测它在生物体内的变化趋势，而带电脂质体与相反电性的分子关系也能通过测量两者产生的聚合物的zeta电位进行监控。这些因素对药物传输的有效性具有显著影响，尤其是当药物配方研究员认为某种脂质体适合传输载体时，应综合考虑以上因素。因此，能提供全面数据的分析系统对配方设计过程大有裨益。纳米颗粒跟踪分析技术和动态光散射技术正是其中两种重要的分析方法，为脂质体研究提供重要信息。 　　纳米颗粒跟踪分析技术 　　纳米颗粒跟踪分析技术(NTA)使用激光散射来检验溶液中的纳米粒度。使用该分析方法，研究人员能够观察到单个粒子并跟踪其布朗运动轨迹，从而基于单个粒子在短时间内快速制出每个粒子的粒径分布图。 图1：纳米颗粒跟踪分析技术效果展示图 　　使用科学数码摄相机可以捕捉溶液中颗粒的散射光，仪器软件可逐帧跟踪每个颗粒的运动轨迹。 图2： 图中光点为布朗运动中的粒子 　　颗粒的运动速度与由斯托克斯-爱因斯坦方程计算出来的球体等效流体力学半径相关。NTA技术能逐粒计算粒度，且因有影像片段作分析基础，用户可精确表征实时动态。 图3：斯托克斯-爱因斯坦方程 　　NTA技术能让研究人员在同一时间观察单个纳米颗粒，因此除基础的粒度分析以外，还能测定每个脂质体的相对光散射强度等。将数据结果与另行测得的粒度数据绘成坐标图，能够更加细致地分辨出由不同折射率(RI)或材料构成的颗粒。凭借这一独特功能，研究人员可探究纳米级药物输送载体(如脂质体)所封装的内容是否有所不同：空心脂质体的折射率(光散射能力)可能低于载有较高折射率物质的脂质体。这样的差异让人们得以区分大小相似的脂质体。此外，NTA的单个粒子检测系统使得颗粒浓度测量成为可能。 　　粒度和zeta电位 　　脂质体与细胞在体内发生作用的位置很大程度上是由脂质体的粒度决定。掌握脂质体制剂的zeta电位有助于预测脂质体在体内的变化趋势。颗粒的zeta电位是指颗粒在特定媒介中获得的总电荷。以基因治疗为例， zeta电位的测量可用于优化特定脂质体与各种DNA质粒的比率，从而将配方的聚集度降到最低。 图4：阳离子脂质体(带正电)与DNA(质粒)的络合 　　动态光散射(DLS)是一项相对成熟的、广泛应用的脂质体表征技术。此外，由于zeta电位也是一项重要参数，能够同时测量粒度和zeta电位的分析系统也日渐普及，马尔文仪器公司的Zetasizer Nano系统正是其中之一。一般而言，研究人员使用动态光散射技术测量粒度，采用激光多普勒微电泳技术测量zeta电位。 　　由颗粒布朗运动产生的光散射也是DLS技术的核心所在。DLS技术测量散射光强度随时间变化产生的波动，并确定颗粒的扩散系数。在此基础上利用斯托克斯-爱因斯坦方程将数据转化为粒度大小分布情况。 　　使用激光多普勒微电泳技术测量zeta电位时，向分子溶液或颗粒分散液施加电场，这些颗粒便会以一定的速率移动，而该速率正与zeta电位相关。通过测定该速率能够计算出电泳迁移率，并据此算出颗粒的zeta电位和zeta电位分布。 　　结论 　　脂质体的物理表征对于理解脂质体在各种应用中的适用性十分重要，快速、可重复的表征是研发及质量管控过程中的一个重要考虑因素。本文介绍的技术能够提供脂质体制剂的粒度、浓度、zeta电位等补充信息。(结束) 　　作者：马尔文仪器公司高级应用科学家Pauline Carnell、马尔文仪器公司技术支持经理Mike Kazsuba 　　联系地址: 　　Malvern Instruments Ltd 　　Grovewood Road, Malvern 　　Worcestershire WR14 1XZ UK 　　T: +44 (0) 1684 892456 　　F: +44 (0) 1684 892789 　　www.malvern.com

脂质体是一种由磷脂分子在水相中自组装形成的球状泡囊体。脂质体具有良好的生物兼容性和低免疫原性，能够保护药物不被降解，是一种极具前景的药物递送载体。近年来，脂质体已经被广泛应用于肿瘤免疫治疗、基因治疗、多模态分子影像等领域。相比于常规的脂质体，靶向脂质体能够有效地改善药物的细胞摄取以及靶向富集能力，能够显著地提升药物递送效率。但是，常用的制备靶向脂质体的方法正面临着一些挑战，例如，操作复杂、耗时久、批次差异性大等问题。近期，中南大学湘雅医院皮肤科、中南大学机电工程学院等研究团队在《Small》（IF=15.153）期刊上在线发表题为 “ One-Step Formation of Targeted Liposomes in a Versatile Microfluidic Mixing Device ” 的原创性论著。该研究提出了一种基于微流控混合器件的靶向脂质体的一步式合成方法，成功实现了多种靶向脂质体的高通量、高可控性制备。使用微流控混合器件制备的靶向脂质体，在光声成像、小动物活体成像、光热治疗等研究中都表现出了优异的靶向性能。据悉，这项研究的第一作者和第一通讯作者单位均为中南大学。20级博士研究生单晗和20级硕士研究生孙鑫为该论文共同第一作者；中南大学湘雅医院皮肤科陈翔教授、赵爽副研究员和中南大学机电工程学院陈泽宇教授为共同通讯作者。 首先，作者基于靶向脂质体的制备流程筛选了微流控混合器的组合方案，提出了微流控混合器件实现靶向脂质体的一步式合成策略。然后，作者使用高精度3D打印技术（nanoArch S140，摩方精密）制作了微流控混合器件(MMD)。 图1 微流控混合器件(MMD)制备靶向脂质体策略图2 微流控混合器件(MMD)制造随后，作者对脂质体的组分、反应机理进行了设计，选择了吲哚菁绿（ICG）作为模型药物以及靶向PD-L1的适配体作为靶向基团，在MMD内发生混合后，巯基修饰的适配体和功能辅料DSPE-PEG-Mal发生共价结合，最终将适配体修饰到脂质体的表面(Apt-ICG@Lip)。 图3 一步式合成靶向脂质体Apt-ICG@Lip反应机理接下来，作者对靶向脂质体Apt-ICG@Lip的性质进行了测试，包括脂质体的粒径分布、重复性、稳定性、包封率、形貌、细胞毒性、适配体结合效率等。结果显示，使用微流控混合器件(MMD)制备的靶向脂质体Apt-ICG@Lip具有粒径小、批次重复性好、稳定性好、包封率高、低细胞毒性、适配体结合效率高等优点，适用于生物医学应用。图4 靶向脂质体Apt-ICG@Lip性质测试接着，为了验证靶向脂质体Apt-ICG@Lip的靶向性能，作者进行了光声成像(PACT)和小动物活体荧光成像研究。作者将高表达PD-L1的LLC肿瘤模型小鼠分为两组，实验组注射靶向脂质体Apt-ICG@Lip，对照组注射常规脂质体ICG@Lip。结果显示，靶向脂质体Apt-ICG@Lip具有更明显的肿瘤摄取和药物富集能力。 图5 靶向脂质体Apt-ICG@Lip光声成像和小动物活体成像研究接着，作者进一步进行了光热治疗研究。作者将LLC肿瘤模型小鼠分为PBS、ICG@Lip、Apt-ICG@Lip三组，在注射药物后分别使用808 nm激光进行照射，观测肿瘤的体积变化，并使用免疫组化和免疫荧光评估了肿瘤的治疗效果。结果表明，Apt-ICG@Lip由于具备主动靶向能力，具有更好的光热治疗效果，也进一步验证了MMD构建的靶向脂质体的性能。 图6 靶向脂质体Apt-ICG@Lip光热治疗研究最后，作者为了验证MMD构建靶向脂质体的通用性，进一步制备了多种不同用途的靶向脂质体。除了吲哚菁绿（ICG）外，作者还选择了FITC、NHWD-870和亚甲基蓝（MB）作为模型药物，并使用MMD制备了一种anti-Her2抗体修饰的靶向脂质体。作者使用Apt-FITC@Lip进行了细胞实验。结果表明，高表达PD-L1的细胞和Apt-FITC@Lip具有更明显的结合效果。 图7 靶向脂质体Apt-FITC@Lip细胞实验该工作提出的微流控混合器件（MMD）一步式构建靶向脂质体的方法，适用于多种靶向脂质体的制备，在靶向药物递送系统（分子成像、肿瘤治疗等）研究中具有巨大的应用前景。

01研究背景1.1脂质体脂质体是一种微型泡囊体，能将药物包封于脂质双分子层内，具有靶向、缓释、降低药物毒性等诸多优点，迄今已经在制药、医疗、生物化学、食品科学、化妆品等多领域广泛应用。评价脂质体质量的指标有外观、粒径分布和包封率等，制备方法不同，脂质体的粒径、结构都不尽相同。脂质体在不同领域应用，粒径是衡量脂质体内在质量的一个重要指标，探头式超声由于操作简便，已成为制备脂质体主要制备方法之一，但是由于超声条件的不同，制备的脂质体没有很好的重现性。影响超声效果因素包括输入功率、作用时间、超声频率等，通过控制这些因素，可以控制脂质体粒径的变化，从而得到理想大小的脂质体。02实验方法2.1脂质体的制备采用逆向蒸发法制备脂质体，精密称取一定量的卵磷脂、胆固醇、α-生育酚适量混合溶于一定量氯仿中，将脂质溶液移入250mL圆底瓶中，氮气中45℃恒温水浴减压去除有机溶剂，直至形成干燥脂质薄膜，待有机溶剂完全去除，停止旋转，从水浴中提起圆底瓶，加入一定浓度的PBS（pH6.5）溶液旋转洗膜，在45℃水浴中水合2h即形成乳白色脂质体混悬液。2.2脂质体溶液的超声方法图1为本实验所用超声装置，钛探针直径为1.5cm，反应池为一个开放的玻璃烧杯（直径3cm，高度7.5cm），冰水浴超声。实验设置20%、30%和40%三个功率百分比，超声处理脂质体，超声仪探针距杯底深度分别设置为1.5和3.0cm。15ml脂质体按上述条件针式冰水浴超声，超声5次，每次时间为4mim（单次超声30s，间隔30s）。超声完成后，关闭超声使容器冷却，用0.22μm微孔滤膜过滤除去钛颗粒杂质。激光粒度仪分析超声对脂质体粒径分布及对分散系数的影响。a：钛探针（直径1.50cm）；b：烧杯（直径3cm，高7.5cm）；c：大烧杯（直径7cm，高90cm）；d：脂质体混悬液；e：冰水浴；x：探针与烧杯底部距离03实验结果3.1超声功率对脂质体粒径的影响不同输入功率，超声时间为20min，脂质体超声后平均粒径及粒径范围分布见附表。结果表明，随着超声功率的增加，脂质体粒径变小，粒径分布范围变窄，说明高功率超声得到的脂质体粒径更均匀。图2为磷脂含量为10mmol/L脂质体超声前后粒径图，超声之前（图2A）脂质体粒径呈单峰分布，平均粒径为300nm左右，随着超声时间的增加，超声20min后能明显观察到粒径变小，粒径分布变窄，见图2B，超声功率为40%时，20min后获得粒径约为70nm左右的单峰分布的脂质体。附表超声输入功率对脂质体粒径及粒径分布影响A：超声前脂质体粒径分布图；B：超声20min后脂质体粒径分布图，输入功率40%；超声时间20min；磷脂含量10mmol/L3.2超声时间对脂质体粒径的影响如图3所示，超声功率分别为20%、25%、30%、35%、40%，增加超声时间，磷脂含量为10mmol/L的脂质体粒径变化，结果显示，随着超声时间的增加，脂质体粒径减小，直到20min时得到一个稳定的脂质体粒径，不再发生变化。为了证实超声时间足够形成稳定的脂质体粒径，增加超声时间到25min，考察脂质体的粒径分布。3.3超声时间对脂质体粒径的影响设定中高低三个超声输入功率20%、30%和40%，烧杯底部和探头的距离分别为10和15mm。在不同的超声功率和深度下，超声时间不同，得到不同粒径的脂质体。图4显示的是磷脂含量为10mmol/L的脂质体，应用超声功率分别为20%、30%和40%，粒径随超声时间的变化图，结果表明，随着超声时间的延长，脂质体粒径降低，直到超声时间为20min，脂质体粒径不在变化，从图中还可以看出，随着超声功率的增加，脂质体粒径降低。应用不同的超声时间和不同的深度，获得的脂质体粒径也不同。考虑到连续的超声时间和功率，深度为15mm时，获得的脂质体粒径更佳。15mm与10mm探针深度获得的脂质体粒径并没有明显区别，然而在10mm时，脂质体空化现象更为明显，促进羟基自由基的形成，造成脂质体成分中磷脂的氧化。15mm深度时磷脂发生氧化的机率更低。这点在应用不饱和磷脂制备脂质体时尤其重要，因为不饱和磷脂容易氧化。从图中可以看出，功率越高，超声得到的脂质体分散系分散得越均匀，随着功率的增加，粒径和分散率降低，但超声时间过长，超声探头会释放更多钛颗粒杂质，造成污染。因此，超声条件为探针深度为15mm、超声功率为40%，超声时间为20min时，得到的脂质体粒径和分散度最好。A：磷脂含量为10mmol/L，超声功率分别为20%、30%和40%时粒径及分散性随超声时间的变化（探头深度10mm）；B：磷脂含量为10mmol/L，超声功率分别为20%、30%和40%时粒径及分散性随超声时间的变化（探头深度15mm）04讨论4.1新芝生物全球样品制备专家超声波是由一系列疏密相间的纵波构成的，并通过液体介质向四周传播。通过研究脂质体制备过程中超声对其影响，来达到控制脂质体性质的目的，实验结果表明，影响脂质体粒径分布范围和zeta电位的三个超声参数分别为：超声深度、功率输入和超声时间。因此，为获得的均一性较好的脂质体应该从此三方面进行探索。新芝生物作为全球样品制备专家，深耕超声技术多年，产品功能齐全，超声产品具有功率调控、时间调控和超声深度调控等多方面功能。从用户实际需求出发，能够为用户提供高效率、高性价比的产品和解决方案。