厌氧微需氧培养系统

在自然环境和人体中，存在着大量厌氧和微需氧菌，它们与人类的生活息息相关。1861年，巴斯德首次发现了厌氧菌，这标志着人类对这类细菌认识的开端。随着研究的深入，开发多功能、智能化的厌氧和微需氧菌培养装置变得日益迫切。杭州华端生物科技有限公司（以下简称：华端生物）在厌氧菌培养领域取得显著成就，其推出的HD-AN系列智能厌氧/微需氧培养系统，填补了培养过程中实时氧浓度监测的技术空白。近日，仪器信息网一行走进华端生物，与公司销售总监黄翰韬对话，深入了解这家年轻企业的技术、产品创新和发展规划。华端生物销售总监黄翰韬从国产替代到自主研发华端生物正式成立于2021年，其创立的初衷是以保障食品安全、药品安全和公共卫生安全为已任，不断研发创新产品，填补国内空白，引领国产仪器共同发展。公司初名并非华端，更名意在成为进口检测仪器的国产替代，并逐步成为行业领导者。1950年，美国科学家发明了厌氧培养技术；1970年，日本三菱公司发明了厌氧产气袋；1975年，第一台厌氧培养箱在英国诞生；2019年，华端生物的首款厌氧/微需氧培养系统进入市场，对标MART公司的厌氧微需氧培养系统。黄翰韬称：“客户对国产仪器有偏见，认为国产仪器质量和服务做得不好，但我个人有一些理想主义的想法，希望产品能够与进口产品竞争，甚至超越它们。” 如今，华端生物在厌氧菌培养设备领域取得了显著成就，其核心产品HD-AN系列智能厌氧/微需氧培养系统，填补了培养过程中实时氧浓度监测的技术空白。传统“基于气体抽排置换法”的厌氧培养装置需要长期处于运行状态，气体消耗量大且不能精确控制微需氧环境，操作时还需要随时查看设备运行情况。华端生物HD-AN系列智能厌氧/微需氧培养系统通过“真空置换抽排原理”精准控制培养罐中气体环境，气体消耗量极低（厌氧环境7L/罐，微需氧环境2-3L/罐），用户可自定义O2/CO2浓度，最快70s生成氧浓度0%-18%微需氧环境，无线氧浓度监测功能更是使培养过程不再“两眼一摸黑”。 HD-AN系列智能厌氧/微需氧培养系统华端生物产品线布局全面，涵盖传统微生物和工业微生物检测。其产品线的布局最早也是借鉴梅里埃等公司的成功经验，覆盖微生物样品采集及富集、样品前处理、厌氧/微需氧培养、样品定性定量分析各环节，形成了一套全流程检测方案。当前，华端生物专注于保障食品安全、药品安全和公共卫生安全，致力于将产品、服务做精做透，自成立以来每年都推出1-2个新产品，客户群体广泛，涵盖疾病预防控制中心、食品药品监督管理部门、海关、高等教育机构、科研单位以及各类企业。“下一步公司也在积极开拓海外市场，准备进军国际市场。” 黄翰韬透漏了其未来市场规划。“卷创新、卷品质、卷服务”从国产替代到行业引领，这一变化的背后离不开创新的驱动。“行业内积累的经验让我们着手去解决客户的迫切需求和痛点，通过对产品进行‘微创新’的后发优势，使其更适合国内市场。”黄翰韬展示了华端生物自主研发和生产的桌面设备——自动细菌涂布仪。他回忆道：“过去作为销售人员，我仅需专注于销售，当我亲自投身于产品开发时，才深刻体会到其中的复杂。这款涂布仪虽然简单，但其核心部件——转轴的设计却很难”。研发时不仅需要确保转轴的平衡性和转速，还要考虑平皿的高度和材质，甚至不同厂家生产的平皿厚度差异。经过一系列的测试和调整后，自动细菌涂布仪可以适配90mm直径的平皿，并且能够适应±1-2mm的误差，这样平皿既平稳又不会松动。这就是提升国产微生物检测设备的竞争力的法宝——持续投入研发、大胆创新产品性能和应用、严抓产品质量。自动细菌涂布仪面对激烈的竞争市场，黄翰韬认为企业不应该仅局限于“卷价格”，应该“卷创新、卷品质、卷服务”，只有各项都做到优秀，才能在激烈的市场竞争中脱颖而出，成为行业引领者。微生物检测仪器行业有一定的门槛，华端生物作为一家国产初创企业，成立不到三年时间，就获得了国家高新技术企业认证，黄翰韬称公司在发展过程中获得了地方政府的大力支持，也有信心通过创新和优质服务提升竞争力。“重视与客户的直接接触，了解客户需求，提供定制化解决方案，通过免费试用和客户反馈，不断改进产品，实现共赢”。国家高新技术企业认证证书国内微生物检测市场发展不足，食品检测、药品检测、环境监测还有很大的发展空间，谈及作为一家国产初创企业当下生存发展面临的最大困难和挑战，黄翰韬自信地说：“虽然有人说今年形势不容乐观，但我个人觉得危机中要发现机会，做好准备，等待市场爆发。正如赵本山大爷所说，‘你不能代表大环境’，无论外界环境如何，我们总能找到机会，占据一席之地。”尽管国产仪器面临巨大挑战，华端生物的产品市场表现仍然良好，核心产品智能厌氧微需氧培养系统在政府检测单位占有一半以上市场，并入围伊利、蒙牛等大型乳企的采购目录。部分产品还远销俄罗斯、非洲、日本等国家，成功打开了出口市场。黄翰韬把这些归功于小公司处理市场反馈更加灵活。他解释道：“客户更倾向于“傻瓜式”的操作，即操作简单直观，无需过多思考如何使用。然而很多大企业被战略规划或较大的生产体量等因素掣肘，无法及时调整，但我们会认真对待客户需求，并根据用户体验不断改进，优化产品性能。” 展望未来，他直言希望能够获得更多关注，“我不怕竞争，怕的是没有竞争的机会”，也会在自身薄弱环节适当的寻求外部合作“公司计划在未来几年内，继续加强产品研发，提升产品竞争力，拓展国内外市场，提升品牌知名度”。走访合影（从左至右：仪器信息网产业研究部陈星羽、仪器信息网生命科学编辑李兆坤、华端生物销售总监黄翰韬、仪器信息网客户成功经理康龙、华端生物市场经理沈玥琳）

使用厌氧培养箱不可忽略的几点厌氧培养箱亦称厌氧工作站或厌氧手套箱。采用紧凑式筒状设计，实现单人单手轻松转移样品。一般由恒温培养室、厌氧操作室、取样室、气路及电路控制系统、箱架、瓶架、熔蜡消毒器等部分组成。内腔机械强制对流与内腔正压，实现恒温、控湿、除氧、生物脱毒四方面状态稳定均一，并且快速恢复，操作培养同室进行。是一种可在无氧环境下进行细菌培养及操作的专用装置，可培养最难生长的厌氧生物，又能避免往厌氧生物在大气中操作时接触氧而死亡的危险性。因此本装置是厌氧生物检测科研的理想工具。是一种在无氧环境条件下进行细菌培养及操作的专用装置。它能提供严格的厌氧状态恒定的温度培养条件和具有一个系统化、科学化的工作区域。相关技术人员表示，使用厌氧培养箱不可忽略下列的几个细节：　　1、厌氧培养箱培养物放入必须是在操作室内达到绝dui厌氧环境后放入。　　2、调换气瓶时，注意要扎紧气管，避免流入含氧气体　　3、真空泵按要求使用，定期检查加油。　　4、整机应安放在温度温差较小，操作方便的位置，应避免阳光直晒和远离采暖设备，放置要平稳。　　5、停止使用，关闭总电源键，及设备后部的电源开关。　　6、开机前应全面熟悉和了解各组成配套仪器、仪表的说明书、掌握正确的使用方法。　　7、仪表尽可能地安装于空气清静，温度变化较小的地方。　　8、如发生故障（停气等原因）操作室内仍可保持12小时厌氧状态。（超过12小时则根据需要把培养物取出另作处理）。　　9、厌氧培养箱经常注意气路有无漏气现象。

结直肠癌是最多发的癌症之一，病死率高居全球第二。目前，利用患者肿瘤组织构建的类器官模型已成为研究肿瘤发生分子机制的常用研究手段。多种肿瘤类器官已被成功构建，包括结直肠癌、乳腺癌、膀胱癌、前列腺癌、胃癌等。然而，这些研究大部分仅在大量细胞系综平均的水平评估了患者组织衍生的类器官的各种分子特征，如基因突变、基因组拷贝数变异以及基因表达等变化，并未在单细胞水平进行评估，从而无法系统地评估构建的类器官个体内部的肿瘤细胞异质性情况，特别是由于构建类器官的成功率常常不是很高，同时得到同一个患者的体内肿瘤单细胞组学数据以及在体外建成类器官后的配对单细胞组学数据非常困难。为了系统地评估结直肠癌类器官培养系统，解析类器官与对应的体内肿瘤上皮细胞之间的异同以及不同培养体系对类器官基因表达特征的影响，北京大学生物医学前沿创新中心（BIOPIC）汤富酬教授团队与北京大学第三医院普通外科付卫教授团队合作，对来自6名结直肠癌患者的体内肿瘤组织和癌旁正常组织，以及对它们进行体外培养建立的相应的类器官进行了高精度单细胞转录组测序，并结合全基因组甲基化测序、全基因组测序、全外显子组测序以及靶位点Sanger测序等，对两种常见结直肠类器官培养体系从转录组、基因组和DNA甲基化组三个层面进行了系统的比较和评估（图1）。该研究成果于2022年4月28日以“Systematic evaluation of colorectal cancer organoid system by single-cell RNA-Seq analysis”为题在线发表在 Genome Biology 上。图1 实验设计方案示意图该研究有以下3个主要发现：1、肿瘤组织来源的类器官能准确反映对应体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）在基因表达、基因突变以及DNA甲基化等方面的关键特征。通过探索体内肿瘤特异性基因表达模式，该研究发现肿瘤来源的类器官高表达体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）特异性表达的基因。并且，肿瘤组织来源的类器官也维持了体内肿瘤上皮细胞特异性的基因调控网络特征。另外，通过对全基因组（WGS）、全外显子组（WES）以及DNA甲基化组（PBAT）数据进行分析，该研究发现肿瘤类器官能非常好地维持体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）在基因突变和DNA甲基化等方面的关键特征（图2）。这表明现有培养体系中的结直肠癌肿瘤类器官非常好地维持了对应患者体内癌细胞的关键生物学特征，因而使用肿瘤类器官筛选的癌症治疗候选药物应该对对应患者体内的癌细胞也会有类似的杀伤效果。现有的肿瘤类器官是肿瘤杀伤药物筛选的优秀平台。图2 体内外肿瘤细胞和正常肠上皮细胞的基因组拷贝数变异、DNA甲基化以及基因突变的比较2、癌旁正常组织来源的类器官在转录组水平上表现出部分肿瘤样特征，但保持正常的基因组和全局DNA甲基化组特征。首先该研究鉴定了体内肿瘤上皮细胞和癌旁正常肠上皮细胞的差异表达基因，并研究了这些差异基因在体外肿瘤类器官和正常肠上皮类器官的表达情况。结果显示，体外正常肠上皮类器官和肿瘤类器官均高表达体内肿瘤上皮细胞特异性表达的基因。为了进一步验证此结果，该研究对体内组织和体外类器官进行了肿瘤特异性表达基因CEACAM6的免疫荧光染色。与单细胞转录组数据一致，CEACAM6仅在体内肿瘤上皮细胞中高表达，而在体内癌旁正常肠上皮细胞中则不表达。然而，体外培养的肿瘤类器官和正常肠上皮类器官均高表达CEACAM6蛋白，此结果与单细胞转录组测序结果一致（图3）。该研究的癌旁正常组织都取自距离肿瘤组织边缘至少10厘米以外的区域，其正常组织内部混杂大量肿瘤细胞的可能性非常低，但为了进一步排除正常组织类器官有可能是混杂在癌旁正常组织中的肿瘤细胞体外扩增而导致这一现象，该研究进一步探究了体外肿瘤类器官和正常肠上皮类器官的基因突变和基因组拷贝数变异情况。结果显示只有肿瘤类器官呈现与对应患者体内肿瘤细胞相似的基因组拷贝数变异和基因突变，而正常肠上皮类器官的基因组与体内正常肠上皮细胞一致，没有肿瘤细胞特异性的基因突变和基因组拷贝数变异，从而排除了正常组织类器官起源于癌旁正常组织中混杂部分肿瘤上皮细胞的可能性。这些数据显示，在转录组和蛋白水平上，肿瘤上皮类器官和正常肠上皮类器官都表现出肿瘤样特征。这表明现有的培养体系使得正常肠上皮类器官也具有部分肿瘤细胞特征，因而用同一个患者得到的肿瘤类器官和癌旁正常肠上皮类器官进行配对药物筛选以筛选出特异性对肿瘤细胞有选择性杀伤效果（杀伤肿瘤类器官，但是不杀伤正常肠上皮类器官）的候选药物目前是无法实现的。图3 CEACAM6免疫染色荧光结果3、条件培养基在肿瘤类器官的长期培养方面优于化学成分确定培养基（分子培养基）。首先，该研究通过MKI67的表达情况对不同培养基中的细胞增殖情况进行了评估（图4）。在化学成分确定培养基（分子培养基）中，正常组织来源的类器官相比肿瘤来源的类器官具有更快的细胞增殖速度。而在条件培养基中，正常组织来源的类器官和肿瘤来源的类器官的细胞增殖速度相当。这说明化学成分确定培养基（分子培养基）更有利于正常肠上皮细胞的生长，而条件培养基对正常肠上皮细胞和肿瘤上皮细胞（癌细胞）的生长没有明显偏好性。而这一特点通过线粒体突变在不同培养基中培养的癌细胞的谱系追踪得到了进一步验证。图4 体内组织以及体外两种培养基中的类器官细胞表达MKI67的比例此外，该研究结果表明，条件培养基比化学成分确定培养基（分子培养基）更能真实地反映对应体内肿瘤上皮细胞（癌细胞）与正常肠上皮细胞的差异。与体内相应的癌细胞相似，在条件培养基中培养的肿瘤类器官呈现肠上皮干祖细胞标志基因OLFM4高表达和肠上皮分化成熟标志基因CA2低表达的特征，正常组织类器官呈现相反的OLFM4低表达和CA2高表达的模式（图5）。然而，在化学成分确定培养基（分子培养基）中，无论是正常组织类器官还是肿瘤类器官都具有相似的OLFM4高表达和CA2低表达的模式，无法准确模拟对应体内不同类型上皮细胞基因表达的不同特征。这表明现有的两种培养体系对维持对应体内肿瘤细胞关键生物学特征都有效，但是条件培养基要优于化学成分确定培养基（分子培养基），因而条件培养基是基于类器官的肿瘤发生分子机制研究和药物筛选的首选培养体系。图5 不同条件下的肿瘤细胞和正常上皮细胞的CA2和OLFM4的表达综上所述，该项研究对结直肠癌体内肿瘤组织、体内癌旁正常组织，以及配对的在两种不同培养体系中建立的肿瘤类器官、癌旁正常组织类器官进行了高精度单细胞转录组分析，并结合全基因组测序、全外显子组测序、DNA甲基化组测序以及靶位点Sanger测序的结果，系统地评估了类器官模型在研究结直肠癌肿瘤发生分子机制上的可靠性和局限性。该研究发现，现有的培养体系中的肿瘤类器官非常好地维持了对应结直肠癌患者体内癌细胞的关键生物学特征，现有的肿瘤类器官是肿瘤发生分子机制研究以及肿瘤杀伤药物筛选的优越平台。现有的培养体系使得正常肠上皮类器官也具有部分肿瘤细胞特征，因而无法用同一个患者得到的肿瘤类器官和正常肠上皮类器官进行配对筛选，以便得到对肿瘤细胞有选择性杀伤效果的候选药物。现有的两种培养体系对维持结直肠癌肿瘤细胞关键生物学特征都有效，但是条件培养基要优于化学成分确定培养基（分子培养基），因而条件培养基是结直肠癌肿瘤发生分子机制研究和药物筛选的首选培养体系。