快速糖化血红蛋白测定仪

p　　近日，融智生物宣布正式推出MALDI-TOF MS法定量分析糖化/非糖化血红蛋白解决方案。/pp　　空腹血糖和餐后血糖是反映某一具体时间的血糖水平，容易受到进食和糖代谢等相关因素的影响。而由于人体红细胞的寿命一般在120天，在红细胞死亡前，血液中HBA1c含量也会保持相对不变，因此HBA1c水平反映的是在检测前120天内的平均血糖水平。所以说空腹和餐后两小时血糖只是诊断糖尿病的标准，而衡量糖尿病控制水平的标准是糖化血红蛋白。目前欧美等发达国家以糖化血红蛋白率诊断糖尿病。糖化/非糖化血红蛋白定量分析已在欧美发达国家取代传统的血糖测试。在中国，越来越多的诊断也开始使用糖化/非糖化血红蛋白定量分析。/pp　　传统上，糖化/非糖化血红蛋白分析的主流技术是免疫法和高效液相色谱法。相较而言，高效液相色谱法精度更高，方法亦相对简单，目前，高效液相色谱法正快速取代免疫法。/pp　　与目前的传统技术相比，融智生物基于新一代全谱可定量飞行时间质谱平台QuanTOF推出的质谱法，具有更高灵敏度、更高效率、更低成本、更简单操作以及更高通量等诸多优势。strong/strong/pp style="text-align: center "img width="500" height="333" title="quantof.jpg" style="width: 500px height: 333px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/1f511bc3-2b2d-4bfd-a2b4-7cb02e7ed6ae.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "strong融智生物新一代全谱可定量飞行时间质谱平台QuanTOF/strong/pp　　所需要的设备除了QuanTOF主机外，只需一台离心机，要求最简化，在试剂方面，也仅需要纯水和基质。/pp　　在定量精度方面，融智生物经多次验证结果显示，QuanTOF的定量重现性接近甚至高于高效液相色谱，完全可做到对传统方法的替代，span style="color: rgb(31, 73, 125) "strong该方法尤其适合于样本量较大、对测试成本敏感的大型用户。/strong/span/pp style="text-align: center "img width="600" height="532" title="1.jpg" style="width: 600px height: 532px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201803/insimg/72717b18-1acc-4633-bd62-6bc22b6c5887.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "strongQuanTOF方法与其他方法优劣比较/strong/pp　　strongiTIPS：对糖化/非糖化血红蛋白定量分析方法的推出，意味着MALDI-TOF MS具备对更多蛋白的定量分析可行性。/i/strong/pp　　span style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="font-family: 黑体, SimHei "附：MALDI-TOF-MS检测糖化血红蛋白方法/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　一、标准曲线制定/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "1、将6个不同水平的糖化血红蛋白标准品，用去离子水稀释200倍，形成稀释标准品待测液。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　2、将稀释标准品待测品与SA基质，按照1:8充分混合，形成待测样品溶液。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　3、将待测样品溶液点在靶板上，静置直至液点完全干燥结晶。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　4、编辑程序进行质谱上机检测，根据所得实验建立标准曲线得到线性关系公式。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　二、样品检测/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　1. 血清的制备，将人全血用去离子水稀释200倍，形成稀释血样待测品。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　2. 将稀释血样待测品与SA基质，按照1:8充分混合，形成待测样品溶液。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　3. 将待测样品溶液点在靶板上，静置直至液点完全干燥结晶。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　4. 编辑程序进行质谱上机检测。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　5. 根据质谱图得出，糖基化蛋白峰面积(A)/糖基化蛋白峰面积(A)+非糖基化蛋白峰面积(B)。/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/ppspan style="color: rgb(31, 73, 125) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "　　6. 计算得出糖化血红蛋白的质谱值=A/A+B，计算得到糖化值。/span/i/spanspan style="color: rgb(0, 0, 0) "ispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/iispan style="color: rgb(31, 73, 125) font-family: 黑体, SimHei "/span/i/span/p

1.氰化高铁血红蛋白HiCN测定法：除SHb外推荐参考方法，具有操作简单、显色快、结果稳定可靠、读取吸光度后可直接定值等优点。致命的弱点是氰-化钾(KCN)试剂有剧-毒，使用管理不当可造成公害。氰化高铁血红蛋白测定法操作(1)直接测定法①加转化液：试管内加5ml?HiCN转化液②采血与转化：取全血20μl，加到盛有转化液的试管底部，用上清液反复冲洗吸管3次，充分混合，静置5min。③测定：以符合WH0标准的分光光度计，波长540nm处，光径(比色杯内径)1.000cm，HiCN转化液或蒸馏水调零，测定吸光度(A)。④计算：根据样本的吸光度(A)直接计算出血红蛋白浓度(g/L)(A为测定管吸光度，44为毫摩尔消光系数，64458/1000为1mol/L Hb溶液中所含Hb克数，251为稀释倍数。)(2)HiCN标准液比色法测定HiCN参考液(50g/L、100g/L、150g/L、200g/L)，分别测得540nm处的吸光度，以参考液血红蛋白含量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线或求出K值。①标准曲线绘制和K值计算②样本吸光度③通过标准曲线查出样本血红蛋白浓度，或用K值计算，血红蛋白浓度Hb(g/L)=K×A。 注意事项(1)HiCN贮存：转化液贮存在棕色有塞玻璃瓶中，不能贮存在塑料瓶中，否则会使CN-丢失，测定结果偏低。HiCN转化液在4℃保存一般可数月，不能在0℃以下保存，因为结冰可使高铁氰-化钾还原，试剂失效。(2)标本：异常血浆蛋白质、高脂血症、白细胞数超过30×109/L、脂滴等可产生浊度，干扰Hb测定。(3)HiCN转化液是一种低离子强度、pH近中性的溶液(7.2±0.2)。样本中白细胞过高或球蛋白异常增高时，HiCN比色液会出现浑浊。(4)氰-化钾试剂是剧，测定后的废液应收集于广口容器中，首先以水稀释废液(1:1)，再按每升上述稀释液加次氯酸钠35ml，充分混匀，敞开容器，放置15h以上，使CN-氧化成C02和N2挥发，或水解成C032-和NH4+，再排入下水道。废液不能直接与酸性溶液混合，因为氰化-钾遇酸可产生剧毒的氰氢酸气体。2.十二烷基-硫酸钠血红蛋白SDS测定法：具有操作简单、呈色稳定、准确性和精-确性符合要求、无公害等优点。但由于摩尔消光系数尚未最后确认，不能直接用吸光度计算Hb浓度，而且SDS试剂本身质量差异较大，会影响检测结果。3.HiN3最大吸收峰542nm，显色快，结果稳定。

近日，北京大学深圳医院检验科纪玲博士团队使用融智生物的QuanTOF质谱平台再次发现新型变异血红蛋白（hemoglobin variant），即Hb-柳州，这是该团队继Hb-辽宁后发现的又一种新型变异血红蛋白。相关研究结果已经发表在Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation上，在此，小融将此篇文献进行解读分享给大家，供参考。血红蛋白（Hb）是由两对α和β珠蛋白链组成的多肽四聚体。血红蛋白变异是最常见的遗传性单基因疾病之一，以血红蛋白结构缺陷为特征。迄今为止，已有超过1350种主要由α-或β-珠蛋白基因突变引起的变异血红蛋白被记录在案，每种变体都具有特定的生物学特性。虽然大多数Hb变异杂合子是无症状的，但一些复合杂合子或纯合子会产生显著的临床症状。因此，对Hb进行产前基因鉴定和咨询具有重要意义。目前，检测血红蛋白组分及其糖化形式的最常用方法是基于阳离子交换高效液相色谱（HPLC）或毛细管电泳（CE）技术。此外，质谱（MS）已被用于分析血红蛋白变异。本文报道了用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）测定HbA1c时发现的一种新的变异血红蛋白，而基于 HPLC和CE技术的HbA1c检测程序未能确定其存在。一位来自广西柳州的23岁妇女来我院做例行检查。她的血糖结果为3.99 mmol/L（参考区间：3.90–6.10 mmol/L）。HbA1c分析最初由Variant II Turbo 2.0进行，与正常对照组相比，在展开色谱图右侧观察到异常凸起。因此，我们进一步检测了残留样本，发现了一个新的Hb变异体，用病人的出生地把它命名为Hb-柳州。使用HPLC系统、硼酸盐亲和层析系统、CE系统（HbA1c程序）和MALDI-TOF MS系统（QuanTOF，融智生物）重新分析HbA1c，用CE系统的Hb程序进行Hb分析。图. 糖化血红蛋白和血红蛋白分析。通过Variant II Turbo 2.0（A），HPLC系统（B），和CE系统（HbA1c程序）（C）检测糖化血红蛋白。血红蛋白分析是通过CE系统的Hb程序（D）。如上图所示，HbA1c结果分别为4.8%（29 mmol/mol，Variant II Turbo 2.0）、4.7%（28 mmol/mol，硼酸盐亲和层析系统）、4.2%（22 mmol/mol，HPLC系统）和4.6%（27 mmol/mol，CE系统）。上述HbA1c技术均未检测到异常峰值。血红蛋白分析也显示97.7%HbA和2.3%HbA2没有异常。图. MALDI-TOF MS（QuanTOF）血红蛋白分析。（A）非变异样品的质谱图显示α-链（15127 Da）、β-链（15868 Da）以及相应的糖基化α-链（15289 Da）和糖基化β-链（16030 Da）。（B） Hb-柳州的质谱图显示一个变异的α-链峰（15155Da）。QuanTOF检测的HbA1c值为4.8%（29 mmol/mol）。同时，在质谱图中发现了质量为15155da的变异链，变异链占总α链的26.4%。基因分析证实了QuanTOF的检测结果。通过Sanger测序发现在HBA1基因上存在一个新的杂合突变[HBA1:C.182A→G]，该突变导致密码子60处的编码从赖氨酸（分子量：146 Da）改变为精氨酸（分子量：174Da）。该结果与QuanTOF的检测结果一致。图.Hb-柳州Sanger序列测定结果。箭头表示杂合突变[HBA1:C.182A→G] 在HBA1基因中。该研究发现了一个新的变异株Hb-柳州，用MALDI-TOF MS代替传统的阳离子交换HPLC和CE的HbA1c检测方法，可以很容易地鉴别出是否存在Hb-柳州。研究结果表明，阳离子交换HPLC和CE法在检测新的血红蛋白变异方面面临挑战。然而，MALDI-TOF MS通过正常和变异链之间足够的质量差可以检测到变异链，可以作为鉴别和定量变异血红蛋白（hemoglobin variant）的选择方法。参考文献：Anping Xu, Weidong Chen, Weijie Xie & Ling Ji (2020): Identification of a new hemoglobin variant Hb Liuzhou [HBA1:C.182A→G] by MALDI-TOF mass spectrometry during HbA1c measurement, Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, DOI:10.1080/00365513.2020.1783698