食用豆制品中蛋白质（凯氏氮）国标测定方法的改善

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食用豆制品中蛋白质（凯氏氮）国标测定方法的改善 1.国家标准相关测定方法 《GB 5009.5—2010 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》详细测定实验过程如下： 1.1原理 食品（豆制品）中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。 1.2试剂和材料 除非另有规定，本方法中所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682 规定的三级水。 1.2.1硫酸铜（CuSO4·5H2O）。 1.2.2硫酸钾（K2SO4）。 1.2.3硫酸（H2SO4 密度为1.84g/L）。 1.2.4硼酸（H3BO3）。 1.2.5甲基红指示剂（C15H15N3O2）。 1.2.6溴甲酚绿指示剂（C21H14Br4O5S）。 1.2.7氢氧化钠（NaOH）。 1.2.8 95%乙醇（C2H5OH）。 1.2.9 硼酸溶液（20 g/L）：称取20 g 硼酸，加水溶解后并稀释至1000 mL。 1.2.10氢氧化钠溶液（400 g/L）：称取40 g 氢氧化钠加水溶解后，放冷，并稀释至100 mL。 1.2.11硫酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L）或盐酸标准滴定溶液（0.0500 mol/L）。 1.2.12甲基红乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1g 甲基红，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。 1.2.13溴甲酚绿乙醇溶液（1 g/L）：称取0.1g 溴甲酚绿，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀释至100 mL。 1.2.14混合指示液：2 份甲基红乙醇溶液与1 份亚甲基蓝乙醇溶液临用时混合。也可用1 份甲基红乙醇溶液与5 份溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。 1.3仪器和设备 1.3.1 天平：感量为 1mg。 1.3.2 定氮蒸馏装置。 1.3.3 自动凯氏定氮仪。 1.4分析步骤 1.4.1试样处理： 称取充分混匀的固体试样 0.2 g～2 g、半固体试样 2 g～5 g 或液体试样10 g～25 g（约相当于30 mg～40 mg 氮），精确至0.001 g，移入干燥的100 mL、250 mL 或500 mL 定氮瓶中，加入0.2 g 硫酸铜、6 g 硫酸钾及20 mL 硫酸，轻摇后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45°角斜支于有小孔的石棉网上。小心加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热0.5 h～1 h。取下放冷，小心加入20 mL 水。放冷后，移入100 mL 容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。同时做试剂空白试验。 1.4.2测定： 向接收瓶内加入 10.0 mL 硼酸溶液及1 滴～2 滴混合指示液，根据试样中氮含量，准确吸取2.0 mL～10.0 mL 试样处理液，以10 mL水洗涤小玻杯并使之流入反应室内。将10.0 mL 氢氧化钠溶液缓缓流入反应室，立即将玻塞盖紧，开始蒸馏。蒸馏10 min 后移动蒸馏液接收瓶，液面离开冷凝管下端，再蒸馏1 min。以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定至终点，其中2 份甲基红乙醇溶液与1 份亚甲基蓝乙醇溶液指示剂，颜色由紫红色变成灰色，pH 5.4；1 份甲基红乙醇溶液与5 份溴甲酚绿乙醇溶液指示剂，颜色由酒红色变成绿色，pH 5.1。同时作试剂空白。 2.化验室试验方法（国标检测方法改善后测定方法） 2.1仪器设备 2.1.1分析天平（AND HR-120） 2.1.2 JKZ10-恒温加热消煮炉（济南精密） 2.1.3 JK9870全自动凯氏定氮仪（济南精密） 2.2试样处理： ①、使用分析天平（AND HR-120）精确称量约0.2g左右的黄豆粉末样品，10ml浓硫酸，2g左右的催化剂（硫酸铜硫酸钾）。 ②、放置于消煮炉上，正常升温至250℃（开始变黑）。 ③、250℃持续30分钟，升至300℃（完全变黑，并开始出现泡沫）。 ④、升温至300℃过程中，同时加入10滴30%的过氧化氢溶液。 ⑤、300℃稳定30分钟，加入10滴30%的过氧化氢溶液。 ⑥、升至350℃，同时加入10滴30%的过氧化氢溶液。 ⑦、稳定30分钟，升至400℃，同时加入5滴30%的过氧化氢溶液。 ⑧、间隔10分钟加入5滴30%的过氧化氢溶液，直至溶液中固体完全溶解。 ⑨、等待溶液变为透明的蓝绿色时继续加热0.5小时。 2.3测定： 消解完之后将样品冷却至室温，即可使用凯氏定氮仪（济南精密 JK9870）测定凯氏氮含量，得到的氮含量乘以相对应的系数可得到蛋白质的含量。 3.本化验室实验方法与国标方法的改善之处 ①.保持样品的取样量不变，减少浓硫酸的加入量，减少催化剂的加入量 ②.消解过程使用消煮炉缓慢升温，控制消解过程炭化的黑色泡沫附着在管壁，以减小对测定结果的影响 ③.消解过程加入双氧水来减弱炭化产生的泡沫，以加快消煮的效率 4.改善方法的解释与方法的论证数据 1.保持样品的取样量不变，减少浓硫酸、减少催化剂的加入量 为改善国标检测方法浓硫酸加入量大，催化剂的加入量大，样品消解后需要定容等操作步骤多的现状，本次实验在保证取样量不变的情况下，减少浓硫酸的加入量，减少催化剂的加入量，经典国标凯氏定氮法充分混匀固体样品的取样量为0.2g-2g，本次实验方法将维持样品的取样量不改变，将催化剂的加入量分别减少为浓硫酸由20ml减少到10ml，将加入0.2g硫酸铜、6g硫酸钾的量减少为加入硫酸铜硫酸钾（1:10）混合催化剂2g左右，两种实验方法检测结果如下表所示： 序号 重量/g 催化剂使用情况 氮含量/% 1 0.2042 国标方法 6.89 2 0.2153 国标方法 6.96 3 0.2129 国标方法 6.94 4 0.2064 国标方法 6.86 5 0.2049 国标方法 6.87 6 0.2113 国标方法 6.90 7 0.2107 改善优化方法 6.99 8 0.2051 改善优化方法 6.85 9 0.2137 改善优化方法 6.99 10 0.1970 改善优化方法 6.85 11 0.1815 改善优化方法 6.88 12 0.2037 改善优化方法 6.88 上述数据说明，两种实验方法的氮含量检测平均值分别为6.90%、6.91%，由此可以得出，按照改善优化方法对催化剂的使用量进行调整之后，对检测结果的影响不大。 2.消化过程控制升温速率以及加入双氧水加快消化速率 样品当中含有大量的有机物，故在消化时候加入浓硫酸以后加热时产生碳化，会有黑色泡沫出现，由于消煮炉配套使用的消化管管径相比于国标方法中定氮烧瓶较细，极易出现黑色泡沫附着在消化管管壁，导致样品的消化不完全。降低升温速率会减弱浓硫酸碳化样品的程度，减少黑色泡沫的出现，进而降低消化时的误差出现。而双氧水时氧化性极强的强氧化剂，能加速样品中有机物的氧化，从而进一步减弱碳化过程黑色泡沫的产生，致使样品的消化速率进一步提升，加速样品的消解，缩短样品的消化时间。以下表格是针对加入双氧水消化和未加双氧水消化黄豆粉末的样品消化时间、氮含量测定结果的比对： 序号 重量g 双氧水加入 碳化黑色泡沫情况 消化耗时 氮含量% 1 0.1965 否 严重 4.5h 6.47 2 0.2042 否 严重 4.5h 6.43 3 0.1978 否 严重 4.5h 6.48 4 0.1993 是 明显减弱 3.5h 6.51 5 0.2129 是 明显减弱 3.5h 6.44 6 0.1894 是 明显减弱 3.5h 6.51 备注：滴定稀硫酸浓度0.0678mol/L 消解催化剂：10ml浓硫酸 硫酸铜硫酸钾（1:10）混合指示剂2g 上述数据说明黄豆粉末消化过程加入双氧水对测定结果没有影响，能明显加快消解的速率，减弱碳化过程黑色泡沫的产生，从而避免了黑色泡沫附着在消化管管壁，进而减少了消化过程的误差，增加了实验结果的稳定性。 5.改善方法实验数据的准确性论证 为了验证改善优化后方法的准确性，选取了不同蛋白质含量（氮含量乘以国标中蛋白质的转换系数）的黄豆粉末分别使用优化后的方法（使用济南精密JK9870）和国标方法进行对比，对比数据如下表所示： 样品名称 蛋白质检测结果/% 相对偏差/% 国标方法 改善优化后方法 样品1 36.32 36.37 0.05 样品2 32.44 32.44 0.00 样品3 31.11 31.10 0.01 样品4 32.38 32.39 0.01 样品5 30.89 30.86 0.03 样品6 32.39 32.44 0.05 样品7 33.15 33.17 0.02 由以上表格数据可以整理归纳出，改善优化（使用JK9870凯氏定氮仪）后的实验方法与国标方法检测结果相对偏差均在0.5%以内，检测结果没有明显差异。 6.使用凯氏定氮仪（济南精密 JK9870）与传统手工滴定法的对比论证 使用凯氏定氮仪测定食用豆制品样品中蛋白质（凯氏氮氮含量乘以国标中蛋白质的转换系数）含量，更能与消煮炉的消化高效的结合起来，相比传统的手工滴定法结果更稳定，误差更小，尤其是待测样品数量较多时，凯氏定氮仪来测定更适合改善优化后实验方法。为了验证凯氏定氮仪的检测结果准确性，采用了同一样品相同的消解方法，消解完成后定容取等量体积的样品稀释液分别使用凯氏定氮仪（济南精密 JK9870）和传统手工滴定法（国标方法）进行样品蛋白质含量的检测。检测数据如下表所示： 样品序号 蛋白质检测结果/% 相对偏差/% JK9870法测试 手工滴定法测试 1 32.85 32.87 0.02 2 32.91 32.90 0.01 3 32.84 32.83 0.01 4 32.98 32.94 0.04 5 32.82 32.83 0.01 6 32.86 32.90 0.04 备注：滴定液浓度：0.0939mol/L 上表数据可以看出使用凯氏定氮仪（济南精密 JK9870）和传统手工滴定法（国标方法）进行样品黄豆粉末蛋白质含量的检测时检测结果的相对偏差在0.5%以内，检测结果没有明显差异，并且使用凯氏定氮仪（济南精密 JK9870）检测起来效率更高滴定更快，能够加快实验进程。 采用改善优化后的化验室实验方法进行氮含量、蛋白质含量的检测时，消化的硫酸的量少，消化后的样品不需要定容即可直接使用凯氏定氮仪（济南精密 JK9870）测定，避免了国标方法需要定容而出现的结晶问题，并且检测结果和国标方法对比无差异，准确度高，改善优化后的实验方法可作为食用豆制品检测的通用方法。 7.改善优化后实验方法的要点 食用豆制品的蛋白质检测，只要消化彻底，蒸馏完全，选择不同量的样品和不同的蒸馏滴定方法对检测结果不影响，采用凯氏定氮仪（济南精密 JK9870）测定更方便、更快捷、更高效。