干细胞 免疫细胞中细胞计数 细胞表型鉴定检测方案(细胞分析)

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中国现代医学杂志China Journal of Modern Medicine第17卷第24期2007年12月Vol. 17 No. 24Dec. 2007 3. Life-Sparing Effect of Human Cord Blood-Mesenchymal Stem Cells in Experimental Acute Kidney InjuryMARINA MORIGl.el STEM CELLS 2010；28：513-522 长流式在细胞治疗上的应用100 e. / 06 VISUALIZE the possibilities. BECKMANCOULTERLife Sciences 目录 细胞治疗概述.·..... 第一章流式细胞仪在干细胞治疗的应用.…..m.m 第一节造血干细胞表型鉴定中的应用…… ..1 第二节外周血干细胞移植中的应用…… ......2 第三节造血干细胞保存中的应用…… .2 第四节间充质干细胞表型鉴定中的应用·.... 3 第二章流式细胞仪在肿瘤免疫细胞治疗的应用…… ....7 第一节细胞因子介导的杀伤细胞(cytokine induced killer， CIK) 疗法…… ..8 第二节树突状细胞(DC)免疫治疗… 第三节树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞免疫治疗 (DC-CIK) 10 第四节yoT细胞疗法… …1C 第五节T细胞受体疗法(TCR) ....12 第六节 CAR-T治疗…… .13 第三章流式细胞仪对细胞治疗的疗效评价的应用…...... …..1入 第四章流式细胞仪分选在细胞治疗的应用…… .18 流式在细胞治疗上的应用 细胞治疗概述 细胞治疗是近几年兴起的疾病治疗新技术，是指利用某些具有特定功能的细胞的特性，采用生物工程方法获取和/或通过体外扩增、特殊培养等处理后，使这些细胞具有增增免疫、杀死病原体体肿瘤细胞、促进组织器官再生和机体康复等治疗功效，从而达到治疗疾病的目的。 细胞治疗以其良好的疗效，副作用小，更个体化、个性化等独特的优势，为一些难治性疾病的治疗，提供了一种选择，有时甚至是最后的选择。在当前和今后很长的历史阶段，细胞治疗都将在临床治疗中担当重要的角色，二十一世纪将是细胞治疗发挥重要作用的时代。 细胞治疗分为两大类：干细胞治疗；免疫细胞治疗。 第一章流式细胞仪在干细胞治疗的应用 干细胞技术，又称为再生医疗技术，是指通过对于干细胞进行分离、体外培养、定向诱导、甚至基因修饰等过程，在体外繁育出全新的、正常的甚至更年轻的细胞、组织或器官，并最终通过细胞组织或器官的移植实现对临床疾病的治疗。 目前临床应用的主要是成体干细胞，这类细胞包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞。 第一节送造血干细胞表型鉴定中的应用 随着近年来造血干细胞移植病例的日益增多，造血干细胞的流式定量越来越成为一个突出的话题。如何准确地定量干细胞数量，什么是有效的质量控制成了各大实验室的话题。 1995年，血液病治疗及移植国际联合会(the International Society of Hematotherapy and GraftEngineering， ISHAGE)成立了干细胞绝对计数(Enumeration)小组，致力于寻求一种简单、快速、灵敏的流式细胞仪检测方法去定量外周血中的造血干细胞数量。这一方法对于临床实验室中不同的流式细胞仪都有效，而且在不同的移植中心具有可比性。这一方案即在96年问世的 ISHAGE 方案，至今为止，其他各种方案改进均以此方案为基础。 干细胞移植对于白血病等多种疾病的治疗具有重要意义，而准确的干细胞绝对计数对于干细胞移植的成败又十分重要。流式细胞仪结合荧光单抗计数为干细胞绝对计数提供了一种快速、定量、重复性好的方法。 ( 文章： ) 1. Single Platform Flow Cytometric Absolute CD341 Cell Counts Based on the ISHAGE GuidelinesMichael Keeney，el Cytometry (Communications in Clinical Cytometry) 34：61-70(1998) 在 EPICS XL 上使用使用 Stem-Kit 试剂盒运用 ISHAGE 法定量检测造血干细胞 第二节5外周血干细胞移植中的应用 正常情況下外周血干细胞含量很少，需要进行动员处理方可有效增加外周血干细胞含量，以供移植时采集。准确计数 CD34+细胞的数量，，可判定骨髓动员方案是否成功，何时开始采集及何时终止采集PBSC。 第三节造血干细胞保存中的应用 造血干细胞保存是造血干细胞治疗技术的重要组成部分，现已广泛用于临床。 脐血干细胞来源广泛，采集方便，，作为造血干细胞容易获得，但需冻存保存，保存条件要求高，规模要求大，需相当投资规模的脐血库来进行保存。 ( 文章： ) ( 脐 血 造血 干细胞 不 同 温度长期冻 存 效 果 的 实 验 研 究 ) ( (许利民，王劲等.《中国现代医学杂志》2007年第24期) ) 文章编号： 1005-89822007)24-3034-03 脐血造血干细胞不同温度长期冻存效果的实验研究 许利民，王 劲，洪 淋，余昌云，张二铁 (第三军医大学大坪医院野战外科研究所血液所，重庆400042) 摘要：目的 通过观察在不同温度条件下长期冻存的效果，以探讨脐血造血干细胞适宜的保存时间。方法以终浓度为5%二甲基亚砜( DMSO)、3%羟乙基淀粉( HES)和4%人血白蛋白( HSA)作为细胞冷冻保护剂，分别采用-80℃冰箱直接冻存和程控降温-196℃液氮冻存，冻存前及冻存3、6及12个月后，应用全自动血细胞分析仪测定脐血单个核细胞( MNC)计数，台盼蓝拒染法显微镜下计数细胞存活率及流式细胞仪测定CD34*细胞计数。结果 在-80℃冰箱冻存3个月后，脐血 MNC 计数、台盼蓝拒染率及 CDs+细胞计数冻存前后比较差异均无显著性。冻存6个月后，脐血台盼蓝拒染率较冻存前差异有显著性( P<0.05)。冻存12个月后，脐血各项指标较冻存前差异均有显著性，其中台盼蓝拒染率差异存在非常显著性( P<0.01)。在-196℃液氮冻存3、6及12个月后，脐血 MNC 计数、台盼蓝染染率及 CD+细胞计数冻存前后比较均无显著差异。结论以终浓度为5%二甲基亚砜( DMSO)、3%羟乙基淀粉( HES)和4%人血白蛋白(HSA)作为细胞冷冻保护剂，脐血造血干细胞在-80℃冰箱中可以有效保存3个月，6个月后存在部分细胞损害，此时的脐血不适合作 干细胞移植。脐血经程控降温-196℃液氮冻存12个月后，造血干细胞仍保存完好，适宜长期保存。 关键词： 脐血；造血干细胞；冷冻保存 中图分类号： R329 文献标识码： B 第四节间充质干细胞表型鉴定中的应用 间充质干细胞是一种来源于中胚层具有自我复制更新和多向分化的多能干细胞，具有独特的免疫表型和免疫调节能力。因此，间充质干细胞被广泛应用于干细胞移植、组织工程和器官移植免疫治疗等方面并且作为组织工程良好的种子细胞被运用于一系列基础和临床研究中。目前比较通用的是国际细胞治疗协会 (ISCT) 2006年推荐的一套定义 MSC 的最低标准。但对于不同来源的 MSC 的特异性鉴别，尚无任何方法和结论。不同实验室分别尝试应用各种不同的表面标记来定义 MSC。 流式细胞术以其高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面的优势在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。应用这一技术，不仅可以用于原代细胞或较低代次细胞的表型分析，还可以应用到细胞传代后的表型稳定性研究中。 文章： 1. Minimal criteria for defining multipotentmesenchymal stromal cells. The InternationalSociety for Cellular Therapy position statementM Dominici， el Cytotherapy (2006) Vol. 8， No. 4，315 317 Table 1. Summary of criteria to identify MSC 国际细胞治疗协会提出了一个鉴定 MSC 的最低标准： 1、在正常培养条件下，MSC 必须贴壁生长； 2、必须表达 CD105， CD73， CD90， 同时不表达 CD45，CD34， CD14 或 CD11b， CD79 a 或 CD19， HLA-DR表面分子 3In vitro differentiation： osteoblasts， adipocytes， chondroblasts(demonstrated by staining of in vitro cell culture) 3、在体外可以向成骨细胞，脂肪细胞，软骨细胞分化。 2. Human Mesenchymal Stem Cells： From Immunophenotyping by Flow Cytometry to ClinicalApplicationsArthur A. Nery，el Cytometry Part A83A： 48-61，2013 总结分析不同来源的间充质干细胞的免疫表型。 Table 1. Immunophenotypic characterization of MSCs of different origins Table 1. (Continued) HMSC+ PLACENTA CELLTYPESHMSC+ SYNOVIAI UMBILICAL UMBILICAL DENTALPLACENTA HASCHASCHASC TISSUE CORD CORD PULP HMSC HMSC CD19 X CD27 X CD28 x X CD31 X CD33 X CD34 X X CD36 X CD38 CD45 X CD50 CD71 CD102 CD105 CD106 CD117 X CD133 CD144 CD243HLA-DR X x FLK-1 MOPC-21， 27-35 FLA-1Reference 20 21 22 23 2 24 25 26 27 28 29 Table 1. Immunophenotype of hCB-MSCs Antigens Percentage of fluorescent cells CD105 55.3±37.3 CD44 62.8±35.1 CD90 90.4±6.9 CD73 98.8±1.9 SSEA4 3.9±4.1 HLAcl I 96.6±2.9 CD146 35±18.1 α SMA 53.5±19.6 CD56 2.1±1.4 DESMIN 0.4±0.3 CK3/12 1±0.7 CK19 2.6±1.7 BB9 0.2±0.1 Data are expressed as mean ± SD. Characterization ofn (h) cord blood-mesen-chymal stem cells (CB-MSCs).(A)： Representative imagee iofhCB-MSCs with typical spindle-d morphology. Originalmagnification， x10. (B)：Osteo-genic differentiation of hCB-MSCs is evidenced by AlizarinRed staining with area of miner-alization. Original magnification，×20. (C)： Proteoglycans stainedby Alcian Blue reveals chondro-ddifferentiation. Originalmagnification， x20. (D)： Flowcharacterization ofhCB-MSCs. Representative dotplots showing the expression ofCD105， CD44， CD90， CD73，HLA class I， CD146， αSMA ofhCB-MSCs at passage 6. The re-spective isotype control is shownared line. Abbreviations：HLA， hyuman leukocyte antigen；oSMA， a-smooth muscle actin；SSEA， stage-specific embryonicantigen. .4. Adipose Tissue-Derived Human Mesenchymal Stem Cells Mediated Prodrug Cancer Gene TherapyLucia Kucerova， el Cancer Res 2007； 67：(13). July 1， 2007 使用 EPICS ALTRA flow cytometer (Beckman Coulter)分析改造前后脂肪来源的MSC 表面标记 CD29， CD44CD90， CD105 的表达情况。通过对 MSC 进行基因改造后用于个体化的肿瘤靶向治疗。 Figure 2. Retrovirus transduction doesnot affect cell surface marker expressionand differentiation properties and directedmigration toward colon carcinoma cellsHT-29 in transgene-expressing CD-AT-MSC derived from cultured AT-MSC.A， AT-MSC and CD-AT-MSC were labeledwith fluorophore-conjugated antibodiesand analyzed by flow cytometry (redhistograms). Mouse isotype antibodiesIgG1 and IgG2a served as respectivecontrols (white histograms). Both cell typeswere positive for CD29， CD44， CD90，and CD105. B， AT-MSC and CD-AT-MSCwere cultured in medium supplementedwith components for adipogenicdifferentiation for 28 d. Cells werestained with Oil Red-O. Red-stainedoil droplets visible in AT-MSC andCD-AT-MSC were indicative of adipogenicdifferentiation. Both cell types were foundto be capable of adipogenic differentiation.Magnification， ×80. C， AT-MSC andCD-AT-MSC were cultured in mediumsupplemented with components forosteogenic differentiation. Cells werestained with Alizarin red S 28 d later.Red-stained calcium deposits weredetected in differentiated cultured AT-MSCand CD-AT-MSC. Both transgene-expressing CD-AT-MSC and AT-MSCwere capable of osteogenic differentiation.Magnification， x160. D， migratory abilityof MSC was determined using a cellinvasion assay kit. AT-MSC and CD-AT-MSC were loaded onto ECMatrix-coatedinserts and incubated with HT-29 cells inserum-free medium. Cell migration wasevaluated after staining under microscope48 h later by taking photographs andcalculating number of migrated cells.Fibroblasts were used as negative control.Columns， mean； bars， SE. There wasno significant difference in the migrationcapabilities of transgene-expressingCD-AT-MSC compared with AT-MSC.However， tumor cells significantly stimulatethe migration of AT-MSC cells comparedwith fibroblasts. Magnification， ×40. *， P<0.05， Mann-Whitney U test. 从人脐带血管外周细胞 (HUCPV)提取间充质干细胞，在 EPICS XL 上检测人脐带血管外周细胞的表型，发现符合间充质祖细胞表型。 Table 1. Flow cytometry results of human umbilical cordperivascularcells labeled for several cell-surface and intracel-lular markers. Data gained from a total of 11 umbilical cordsin whichn≥3. Marker Expression CD105(SH2) ++ CD73 (SH3)a ++ CD90(Thyl) ++ CD44 ++ CD117 (c-kit) 15%+ MHCI 75%+ MHCII CD106(VCAM1) STRO1 D123(IL-3) SSEA-4 Oct4 HLA-G CD34 CD235a(glycophorinA)' CD45 Data refer to cells at PO through P5，except for a(P3)and (P1through P5). Abbreviations：++，298%；-，<1.5%；MHC， majorhistocompatibility complex. 第二章流式细胞仪在肿瘤免疫细胞治疗的应用 肿瘤免疫治疗可以广义地分为非特异性和肿瘤抗原特异性两大类。非特异性的手段包括免疫检验点阻断和非特异地激活免疫细胞；而肿瘤抗原特异性的方法主要是各种各样的肿瘤疫苗和过继免疫细胞疗法。 过继性免疫效应细胞治疗 (adoptive cell transfer therapy， ACT)，是指从肿瘤患者中分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者转输，从而直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞。 为规范细胞治疗技术的临床应用，保证医疗质量和医疗安全，卫生部先后制定了《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，《自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术管理规范》(试行)。细胞制品的质量控制其中包括细胞总数、活性，细胞的纯度和均一性及生物学效应。 细胞表型是细胞基本生物学性质之一。在细胞生物学的研究中，细胞表型反应出细胞群均质程度、细胞生物学功能、细胞分化程度、细胞衰老程度，是细胞产品的最为重要的质量标准。流式细胞术是检测细胞表型的通用技术。 第一节，细胞因子介导的杀伤细胞 (cytokine induced killer， CIK) 疗法 最初是指在正常人体外周血中只占1~5%的 CD3+CD56+的T淋巴细胞。目前国内外制备的用于过继免疫治疗的 CIK 细胞，实际上是体外扩增出的勺 CD3+CD56+、CD3+CD8+为主的异质性细胞群。该细胞群是在多种胞因子如IL-2、IFN-V 及某些单克隆抗体的刺激下，由从外周血、骨髓或脐血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有广泛的非MHC 限制的极强的溶瘤活性。 1、流式细胞术对 CIK 培养条件的优化的应用 文章： Optimized Protocols for Generation of Cord Blood-derived Cytokine-induced Killer/Natural KillerCells 本文分别了解不同细胞因子组合扩增的脐血 CIK、NK 细胞对人K562细胞株的杀伤活性的差异性。使用三组细胞因子诱导脐血 CIK 和 NK 细胞的扩增，A组： SCF，IL-2，IL-7，IL-15； B 组： SCF， FLT3 ligand，IL-2，IL-7，IL-15；C组：IL-2，IL-7，IL-15，通过 Beckman Courter FC500 流式细胞仪对培养后细胞表型 CD3+CD4+CD3+CD8+， CD3+CD56+， CD3-CD56+的分析，认为B组方案能够同步有效的诱导脐带血CIK 和 NK 细胞的扩增。 Day 0 Day 14 Day 21 CD3*CD8+ T-cells 图示：使用A，B，C组方案后0，14，21天测定 CIK， NK，.TT 细胞的表型结果。 CIK 治疗后肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群和NK 细胞变化研究* 段秀梅 谭 岩方艳秋 许淑芬 熊伟吉林大学第一医院中心实验室 长春市 130021) 摘要 目的：探讨 CIK Cell Induction Killer)治疗后肿瘤患者的免疫功能状态。方法：采用流式细胞术检测20例肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞。结果：肿瘤患者 CD3*、CD4*、CD3-/CD16+56*细胞和 CD4/CD8 比值明显低于对照组并呈显著性差异，而CD8+细胞高于对照组 P<0.01)。 CIK 生物治疗后CD3+、CD4*、CD3-/CD16+56*细胞和 CD4/CD8比值都升高，其中 CD4*、CD3-/CD16+56*细胞与治疗前比较呈显著性差异 P<0.05)，而 CD8*细胞与治疗前比较降低 P<0.05)。结论：肿瘤患者的免疫功能低下， CIK 生物治疗能够提高机体的免疫功能。流式细胞术对患者免疫功能的监测，具有快速、灵敏、准确的特点，对于评价疗效、判断预后具有重要价值。 关键词 流式细胞术 肿瘤 T细胞亚群 NK细胞 免疫功能 中图分类号：R730.51 文献标识码：A 文章编码：1000-81792003)07-0491-03 第二节树突状细胞 (DC) 免疫治疗 树突状细胞(DC)是唯一能刺激初始T细胞活化的专职抗原递呈细胞，具有很强的抗原递呈功能，因此日益受到免疫治疗的科研和临床工作者的重视。DC 来源比较广，包括骨髓、外周血、脐带血等，但该种细胞在机体内含量极低。近年来，体外培养DC获得成功，为其功能及分化状态的深入研究和在肿瘤生物治疗领域中的应用创造了条件。 目前国内外比较公认鉴定 DC 主要采用 CD1a 和 CD83分子。CD1a 是鉴定人外周血与骨髓中 DC 的最好标记，所以采用 CD1a 阳性细胞数的多少来反映 DC 的数量；CD83分子是DC 的成熟标记，在DC培养早期不表达CD83分子，当成熟时才表达 CD83分子，目前研究中也主要用 CD83分子的表达量来比较不同来源或不同细胞因子、不同培养方法获得的 DC的成熟度。另外，成熟 DC 表面表达丰富的有助于抗原提呈的分子，如高度表达MHC工、1类分子，共刺激分子 B7.I(CD80)，B7.2(CD86)，细胞间粘附分子 CD40，IC AM-1(CD54)等。 文章： Fmono 1. The cryopreservation ofhigh concentrated PBMC fordendritic cell (DC)-based cancerimmunotherapy 本文研究比较了来源于新鲜PBMC和冷冻保存的高浓度 PBMC 的未成熟和成熟的 DC 的表型和功能。使用 FC500 检测了 CD14， CD80，CD83， CD86， HLA-ABC， HLA-DR. 第三节树突状细胞联合细胞因子诱导的杀伤细胞免疫治疗(DC- CIK) DC-CIK 免疫细胞治疗，是在体外分离培养外周血细胞，诱导其分化为树突状细胞(DC)，再用经抗原刺激的树突状细胞诱导 CIK 细胞产生特异性肿瘤杀伤作用的治疗技术，即CIK 与 DC细胞进行共同培养而成的杀伤性细胞群体(DC-CIK)。其杀伤机制表现为直接杀伤作用和免疫效应细胞参与的间接杀伤作用，这对于细胞免疫功能低下的患者，尤其是白血病患者更为适合，并且能起到清除患者体内微小残留病灶的作用。 文章： 1. DC-CIK 细胞临床制备规范化研究 张志伟，宋鑫中国肿瘤2011年第20卷第2期 本文结合国内外知名实验室的制备经验，对 DC-CIK 细胞制备的技术规范进行探讨，以保证其临床应用的质量和安全。文章指出用流式细胞仪检测 CIK 细胞免疫表 HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD45 和CD56等的表达，其 CD3+CD56+的细胞应达到20%以上。DC 细胞免疫表型 HLA-ABC、HLA-DR、CD3、CD4、CD8、CD11c、CD40、CD45、CD56、CD83、CD80 和 CD86 等的表达。 第四节voT细胞疗法 yoT细胞在先天性和后天性抗肿瘤的免疫反应中，发挥着重要的作用。目前在肺腺癌、胰腺癌、、肾细胞癌以及大肠癌等多种肿瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞中发现yoT 细胞的选择性扩增，，证明 yoT 细胞在肿瘤免疫中具有重要作用。yOT细胞能够杀伤对 NK 细胞敏感和抵抗的靶细胞，并在IL-2存在的条件下得以增强。它可以识别非肽类抗原、MICA/B及MHC肽复合物等。绝大多数 yoT 细胞表现为 CD4-和CD8-，也有少数的vOT 细胞表现为 CD4+或 CD8+。 yǒT 细胞表面还表达标记蛋白 CD28、CD40L、抑制性NK 细胞受体和激活受体 NKG2D。 文章： 1. A doptive immunotherapy of cancer using ex vivo expanded human yǒT cells： A new approach本文探讨一种新的yoT细胞体外扩增方法，使用 FC500 检测培养14天后细胞表型：>85% yoT cells (87-95%) 1-5% aB DN (aB TCR+， CD4-CD8-，CD16-)， 1-3% NK cells(CD3-CD56+)，1-5% CD4+ orCD8+ aB TCR+ cells. yoT 细胞特性：表达中心记忆 (CD27，CD62L，CD28，CCR7，CD127， CD45RO)和活化Ｔ细胞(CD69， HLA-DR， CD80/86)的情況。评估v心T细胞抗肿瘤作用：高表达穿孔素和颗粒酶B， IFN-y和 TNF-a；高表达凋亡亡体 FasL和 TRAIL。 Table 2Surface marker expression of ex vivo expanded y8 T cells. Surface Mean SD Minimum Maximum markers (%) (%) (%) (%) Memory CD27 66 14 55 84 markers CD62L 22 16 5 40 CD28 16 9 9 30 CCR7 1 2 3 CD127 2 2 0.2 3 CD45RO 89 9 79 98 Activation CD69 63 7 54 70 markers HLA-DR 56 4 53 58 CD80/86 35 7 35 35 y8 Subtype V82 (%y8) 52 24 10 75 V81 (%y8) 37 20 20 70 Frequency of ex vivo expanded y8T cells expressing activation/memorymarkers as well as yo T cell subtypes is shown (n=5 differentindividuals). 130 P. Dokouhaki et al./Cancer Letters 297 (2010) 126-136 第五节T细胞受体疗法(TCR) 提取患者外周血中的普通T细胞，通过病毒载体引入新的基因，使其表达能够识别癌细胞原的 TCR 以及一些免疫因子，从而激活引导T细胞寻找杀死癌细胞。 文章： 1. Novel adoptive T-cell immunotherapy using a WT1-specific TCR vector encoding silencers forendogenous TCRs shows marked antileukemia reactivity and safety Blood.2011 Aug 11；118(6)：1495-503. 抗肿瘤活性的降低以及严重的自身免疫反应成为主要问题。为了解决这个问题，本文建立了一种新的逆转录病毒载体系统，为内源性的 TCR 基因编扁 siRNA。在这项研究中，为测试 siTCR 基因治疗人类白血病的临床应用，本文仔细研究了 WT1 siTCR- 转导的T细胞的有效性和安全性。利用 Gallios 检测了各种处理后的 CTL 细胞的引入的 WT1-siTCR 的表达水平、以及 WT1-TCR 基因转染过的 CD8+T细胞中 CD107a的表达水平以及细胞内的IFN-r 表达水平；此外还测测了人源化老鼠的造血干细胞(CD34+)上一些抗原的表达情況。 CD8 Peptide concentration (uM) Control CTLs (spleen) Control CTLs (BM) Myeloid cells T cells B cells Hematopoietic Myeloid cells progenitor cells Megakaryocytes Erythroblasts 兰 1 8 omo +hCD45 +hCD45 +hCD45 1 10 10 10 10 →hCD45 > hCD34 hCD45 · hCD45 WT1-siTCR-transducedCTLs (spleen) WT1-siTCR-transduced CTLs (BM) Hematopoietic Myeloid cells progenitor cells Megakaryocytes Erythroblasts MO OM二A- 10 101o 10 10 10 10 10 10 10 10 10 1o 10 →hCD45 hCD34 hCD45 +hCD45 第六节CAR-T治疗 CAR-T 免疫疗法是利用T细胞来抵抗癌症，这是一种新型有前景的疗法。该疗法是从患者血液中分离出Ｔ细胞然后在实验室对其进行基因改造，通过逆转录病毒和慢病毒载体、转座系统(如SB转座系统)或直接将 mRNA转导到Ｔ细胞内，使T细胞表面表达嵌合抗原受体(CAR)。在实验室对这些Ｔ细胞进行扩增后回输到患者体内，然后这些Ｔ细胞可以找出癌细胞对其发起精确的免疫攻击。 CAR-T 作为特异性细胞免疫治疗已经开始尝试应用于淋巴瘤、、白白血病、骨髓瘤以及一些实体瘤的临床治疗(CART19，20，138等)。目前，用于临床治疗研究的主要为第2代 CART 细胞技术，其中用来携带CAR 的载体主要来源于逆转录病毒和慢病毒。 对于基因修饰T细胞，有许多因素可能和活性有关，包括基因载体、培养条件、 CAR 结构、细胞类型以及该细胞类型的比例。目前，最简单的活性指标是 CAR+ 细胞的数量 文章： 1. Combining CD19 Redirection and Alloanergization to Generate Tumor-Specific Human T Cells forAllogeneic Cell Therapy of B-Cell MalignanciesJeff K. Davies el. Cancer Res； 70(10) May 15， 2010 本文应用 Alloanergization 在 CD19特异性T细胞，』，而又不影响 CAR的效应功能，从而选择性的减少同种异体反应。使用流式细胞仪检测 CD19-CART细胞增殖情況(CFSE法)，同种异体反应的评估(CD3，，CD4， CD8， CD19， IFN-Y， TNF-a)以及 CD19-CART 抗原的表达情況(CD4， CD8，记忆性T细胞(CD27negCD45RO+)，中心记忆性T细胞(TmCD28+CD95+ orCD62L+CD45RO+)， CAR)。部分实验在 FC500 上完成。 图示：成人供体来源的 CART19 的产生和 Alloanergization 的流程图 Table 1. Percent of CD4*and CD8+ subsetsof nonalloanergized and alloanergizedCD19-specific CAR* T cells proliferating afterrestimulation with alloantigens or mitogenicCD3 and CD28 antibodies Allorestimulation Mitogen restimulation CD4* CD8* CD4* CD8* Nonalloanergized 21 (±6.2) 15(±6.1)53(±5.1)48(±3.6) cells Alloanergized 6.9(±4.7)4.1(±3.6)61(±8.4)59(±9.7) cells P* 0.01 0.02 0.30 0.22 NOTE： Numbers in parentheses indicate SD.*Two-tailed paired t test comparing values for nonalloaner-gized and alloanergized cells. 图示：使用 CFSE 检测 nonalloanergized 和 alloanergizedCART-19 细胞在 CD3 和 CD28共刺激下 CD4+和CD8+亚群的增殖情況。 —Allorestimulation —SEB stimulation 图示： CD19-CAR 在 alloanergization 前后的表型检测， CD4+， CD8+细胞，记己性T细胞 (CD27negCD45RO+)，中心记忆性T生胞(TmCD28+CD95+orCD62L+CD45RO+)。 1D 图示： nonanergized 和 alloanergized 的 CD4+CD19-CAR细胞在OKT3-CD19+aAPC下增殖21天后在 CAR 的表达 情況。在 Anergization 前后的 aAPC 增殖的 CD19-CAR 细胞表达 IFN-r 的情況。 102/ 102 Forward scatter 2. Transfection of chimeric anti-CD138 gene enhances natural killer cell activation and killing of multiplemyeloma cells Hua Jiang， el Molecularoncology. 2014， 8：297e310 本文设计了含有嵌合抗原受体的转基因 NK-92MI 细胞系，嵌合抗原受体包含 anti-cd138单链可变片段(scFv)和 CD3*链中的信号分子片段，从而增强 NK 细胞对 CD138阳性多发性骨髓瘤(MM)细胞的细胞毒作用。使用 Navios 流式细胞仪检测 CD138 表达情況，感染效率(EGFP)，细胞表面 CAR-NK的表达，细胞凋亡(Annexin-V 和PI，对靶细胞的杀伤性)，CD107a 和 FasL 表达检测(凋亡机制检测)。 图示：通过流式检测空载体和 CAP-载体的 EGFP 表达率确定稳定转染细胞的效率(>95%)。 图示：效应细胞和靶细胞不同比例(E：T)混合下， nk-92mi-mock 和 nk-92mi-scfv 对 RPMI8226的细胞毒性作用的检测。结果重定向 nk-92mi-scfv 细胞系显示出显著增强的细胞毒作用。 EGFP 图示：C：NK-92MI-scFv or NK-92MImock 和骨髓瘤细胞以 E： T1：1共培养，加入 CD107a 和同型抗体1h，加入莫能霉素3h后， 检测 EGFP阳性的 CD107a 表达。E： NK-92MI-scFv or NK-92Mlmock 和骨髓瘤细胞以E：T1：1共培养 4h， 加入CD178(Fas-L)和同型抗体，检测EGFP阳性的 Fas-L表达。 第三章流式细胞仪对细胞治疗的疗效评价的应用 开展肿瘤病人外周血免疫指标的流式细胞仪检测，运用流式细胞术的方法，检测T淋巴细胞表面抗原(CD3、CD4、CD8)，B淋巴细胞表面抗原(CD19、CD2O)，自然杀伤细胞(NK) 表面抗原(CD16+56)在恶性肿瘤病人外周血中的表达，并检测活化T、B、NK淋巴细胞的免疫指标的变化，淋巴细胞在肿瘤中的表达状况，并进一步分析恶性肿瘤病免疫治疗前后的免疫功能改变，对肿瘤患者的诊断、治疗有非常重要的指导意义。免疫可影响肿瘤生长，肿瘤的宿主也会发生免疫的改变，如果能使免疫低下的恶性肿瘤病人免疫功能得以调节，必然有利于肿瘤的控制。 中国肿瘤生物治疗杂志 http：//www. biother. org Chin J Cancer Biother， Aug. 2012， Vol. 19， No. 4 DOI： 10.3872/j. issn. 1007-385X.2012.04.0014 ·临床研究· 放疗联合自身免疫细胞治疗宫颈癌的临床疗效 朱月华，刘军权，曹卉，陈惠萍'，陈复兴，陈玲，张颂，吕小婷(1.中国人民解放军第97医院妇产科，江苏徐州221004；2.中国人民解放军第97医院生物治疗中心，江苏徐州221004) 摘 要] 目的：比较自身免疫细胞联合放疗与单纯放疗后宫颈癌患者的细胞免疫功能变化和生存期差异。方法：68例宫颈癌患者，放疗组38例，联合治疗组30例；分离患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell， PB-MC)，分别诱导培养 CD3 AK 细胞、 CIK细胞(cytokine-induced killer cell)、树突状细胞(dendritic cell， DC)、y8T细胞和NK细胞。流式细胞细检测治疗前后患者外周血 CD3*、CD4*、CD8*、CD19*、CD16*CD56*和 y8T细胞的比例和数量及 PBMC 中穿孔素、颗粒酶 B和 CD107a阳性表达率。对患者进行5年随访。结果：联合治疗组大多患者生活质量均有改善，联合组卡氏评分高于放疗组(P<0.05)。联合组治疗后患者的免疫细胞绝对值显著高于放疗组(P<0.05)；PBMC的穿孔素、颗粒酶及 CD107a均高于治疗前(P<0.05)，并显著高于放疗组(P<0.05)。联合治疗组中，患者(Ib-Ⅳ期)1、2和5年总生存率分别为93.3%(28/30)、83.3%(25/30)和76.6%(23/30)，明显高于放疗组的86.82%(33/38)、68.4%(26/38)和57.9%(22/38)(P<0.05)；以Ⅱb和Ⅲ期患者疗效最显著。结论：放疗联合自身免疫细胞治疗宫颈癌能提高患者的免疫功能，并延长生存期。 关键词 宫颈癌；过继免疫治疗；放射治疗；免疫功能；免疫细胞 中图分类号] R737.33，R730.51，R730.55 文献标志码 A 文章编号 1007-385X(2012)04-0421-07 第四章流式细胞仪分选在细胞治疗的应用 高免疫活性、长期体内存活效应细胞的获取与高效富集是肿瘤 ATC成功的关键。单克隆抗体的特异性和多样性是利用不同抗体的合理组合分离不同类型的细胞成为可能。流式细胞分选技术能够对细胞进行分离以确保纯度、细胞活力。 分选造血干细胞 临床上白血病的成功治疗归功于对造血干细胞的深入研究和认识，尤其是成功鉴定造血干细胞的表型后，富集纯化造血干细胞用于各种基础研究和临床应用。流式分选是目前富集纯化造血干细胞最重要的方法。目前认为人的造血干细胞的标志为 Lin-CD34+CD38-，人的 Lin标记主要包括 CD3， CD19， CD2O， CD16， CD14， CD11b 和 CD15等。人造血干细胞的分离纯化可以选择骨髓，胚胎和脐带血的单细胞悬液。 分选侧群干细胞 SP细胞的研究增加了对干细胞增殖，纯化及发育调控机制的理解，同时还提供了一种从不同组织中分离纯化和利用多能干细胞的新策略，为组织工程和细胞治疗提供了新的干细胞材料来源。 Hoechst33342是一种亲脂性 DNA 荧光染料，可以自由通过活细胞的细胞膜进入细胞内，与 DNA结合，所以可以直接标记活细胞的 DNA。干细胞能够通过 ABC 运输蛋白 Bcrp1/ABCG2 将细胞内的 Hoechst33342 泵出细胞外，而其他纸胞没有这种能力，所以用该染料标记时，干细胞染色较低，在流式图上能够明显区分与其他细胞。 分选肿瘤干细胞 肿瘤干细胞的概念于20世纪80年代末被首次提出，肿瘤干细胞最早在白血病肿瘤细胞中发现，后来在实体肿瘤中也发现肿瘤干细胞。鉴定分选肿瘤干细胞主要有两种方法：：1.1、肿瘤干细胞本质上是一种干细胞，，可以用 Hoechst33342 染色肿瘤细胞后，流式分选侧群干细胞，，分选得到的侧群干细胞可能就是富集的肿瘤干细胞。2、根据表型标记分选肿瘤干细胞。但鉴定出的每一种肿瘤干细胞的表型都型同，如乳腺癌的肿瘤干细胞为 CD44+CD24-/lo，脑肿瘤和结肠癌的肿瘤干细胞为CD133+。 ( 文章： ) 1. Nigericin selectively targets cancer stem cells innasopharyngeal carcinoma Cheng-Cheng Deng，el The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 45(2013)1997-2006 鼻咽癌(NPC)在中国南方，北非和阿拉斯加是非常普遍的癌症。NPC 病人的预后在早期还是不错，但是在晚期很差。肿瘤干细胞(CSC)被认为与肿瘤的发生、再发和转移都有关系，较差的预后性可能由于治疗之后残留的 CSC。本论文旨在研究靶向治疗鼻咽癌中 CSC， 我们使用高含量或者低含量的 CSC 的 NPC细胞系，研究抗生素 Nigericin 对CSC的影响。本文使用MoFlo XDP分选 SP 干细胞，发现 Nigericin 可以选择性的以 CSC作为靶向目标，同时对于广泛使用临床药物 cisplatin 治疗的 NPC 更为敏感。而且polycomb group 蛋白 Bmi-1的下调也会导致 Nigericin 对CSC的抑制效应。通过 NPC 细胞系的研究发现 Nigericin显著的降低肿瘤的迁移和入侵的能力，这也与 CSC相关。综合以上，我们认为在鼻咽癌中 Nigericin 选择性以 CSC为靶向目标，可作为临床诊断的肿瘤干细胞靶向药物。 Hoechst 33342 Red (intensity) 肿瘤ATC包括效应细胞分选、体外扩增、体外处理、回输治疗等步骤。 下图为某医疗单位的治疗过程 immunopathological and clinical evaluation 只识 归 贝克曼库尔特商贸(中国)有限公司 全国产品咨询热线：4008218899 全国售后服务热线：4008855355/800820 5355 官方微信 上海 北京 广州 杭州 福州 成都 昆明 口 021-38651000 010-65213000 020-85187188 0571-8767 8208 0591-8850 5800 028-86210135 0871-63617528 南京 武汉 西安 济南 郑州 沈阳 哈尔滨 025-6667 6033 027-88232300 029-8833 7440 0531-80965011 0371-55637430 024-31958690 0451-55550637 口 手机官网 流式细胞仪结合荧光单抗计数为干细胞绝对计数提供了一种快速、定量、重复性好的方法。流式细胞术以其高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面的优势在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。应用这一技术，不仅可以用于原代细胞或较低代次细胞的表型分析，还可以应用到细胞传代后的表型稳定性研究中。细胞表型是细胞基本生物学性质之一。在细胞生物学的研究中，细胞表型反应出细胞群均质程度、细胞生物学功能、细胞分化程度、细胞衰老程度，是细胞产品的最为重要的质量标准。流式细胞术是检测细胞表型的通用技术。