病毒分离中离心方法检测方案(离心机)

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Check for updatesOPEN 为什么要分离病毒及构建假病毒? 新冠病毒引发的疫情已经在全球范围内爆发，目前确诊感染人数已经超过160万，并且这一数值还在持续增长中。在疫情爆发初期，我国科研战线迅速行动，在短时间内取得重大进展，其中最重要的是，科研人员不到一周时间就确定了新冠病毒的全基因组序列并分离得到了病毒毒株，及时向全球共享。那么为什么分离病毒毒株这么重要呢? 病毒毒株的分离对于疫情的防控、抗病毒药物的筛选、疫苗研制等都具有重要意义。首先，分离病毒毒株后，可以得到新冠病毒包括衣壳蛋白、全基因组序列在内的更详细的信息，帮助快速诊断试剂盒的研发，这对于新冠肺炎患者的临床诊断和治疗有非常积极的帮助，有利于进行疫情的防控。其次，得到病毒毒株后，将助力于其致病机理的研究，例如新冠病毒与宿主的结合机制、感染病毒后细胞内的免疫应答等等。最后，最重要的是，病毒毒株的成功分离可以帮助进行抗病毒药物的筛选和疫苗的研发。正如中国工程院李兰娟院士所说， "分离出病毒毒株，意味着我们已经拥有了疫苗的种子株。用其制作疫苗株并通过检测后，就可以制备疫苗”。 (左图1：新冠病毒电镜照片(来自中国微生物组数据中心)；右图2：新冠病毒透射显微镜图像(来自NIAID-RML)) 然而，虽然目前全国各地新冠实验、药物研发如火如荼的开展，但是基于新冠病毒的高传染性与高危险性，新冠病毒毒株较难获得，企业早期研发不易推进。究其原因，首先是培养新冠病毒对于实验室要求极高，至少使配备负压系统的生物安全水平三级(BSL-3)实验室，其次实验人员资质、工作流程、污染物的处理都要通过严格的审核，并得到国家卫健委批准。 面对疫情的威胁，随着科学家们不断深入地了解和研究，开发表达刺突蛋白(S蛋白)的新冠假病毒成为辅助治疗性筛选的有力工具。截止到目前为止已有多篇基于 SARS-CoV-2假病毒中和抗体活性检测的文章发表在国际权威杂志上。不仅可应用于血清中和抗体检测，还为后续单克隆抗体及抗病毒药物筛选和评价、疫苗研发及病毒感染机制研究等奠定了基础。 ARTICLE https：//doi.org/10.1038/s41467-020-15562-9 Characterization of spike glycoprotein ofSARS-CoV-2 on virus entry and its immunecross-reactivity with SARS-CoV Xiuyuan Ou14， Yan Liu14， Xiaobo Leil4， Pei Li， Dan Mil， Lili Ren， Li Guol， Ruixuan Guol，Ting Chen'， Jiaxin Hu'，Zichun Xiang， Zhixia Mu， Xing Chen， Jieyong Chen， Keping Hu， Qi Jin1， Jianwei Wango1&Zhaohui Qian D (图3：由中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所的研究团队在国际顶级学术期刊 Nature 的子刊 Nature Communication 上发表——《Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2on virus entryand its immune cross-reactivity with SARS-CoV》。此项研究构建 SARS-CoV-2S蛋白假病毒系统和 293T的 hACE2 稳转细胞系，以此确定 SARS-CoV-2的易感细胞系、病毒受体、侵入途径和蛋白酶激活，揭示了 SARS-CoV-2入侵人体细胞的具体过程。) (图4： SARS-CoV-2-S假病毒包装过程，图源： https：//mp.weixin.qq.com/s/8KPqsmOPKERInDPZSHFkCA) 假病毒依据已公开的序列而制备成一种具有原病毒的基本特点和免疫原性，同时又不具备致病性，方便实验室大规模使用的替代物。由于其生物安全风险较低(仅要求又验室生物安全级别二级(BSL-2))，质控方法可控，可以长期稳定制备和供应。假病毒因其具有“逼真”、稳定、安全等特点，已被广泛用于研究感染机制，受体识别和病毒抑制，以及开发和评估抗体和疫苗。 而假病毒的构建通常都依赖于病毒载体系统的重组包装得到。理想的病毒载体同样也表现出基因组稳定性、细胞型特异性、有效感染率高、对受感染细胞生理机能影响小，同时致病性小等特点。借助病毒载体，例如，慢病毒 (Lentivirus)、水泡性口炎病毒 (Vesicular Stomatitis Virus， VSV) 腺病毒 (Adenovirus)、腺相关病毒 (Adeno-associated Virus， AAV) 将外源基因转导入细胞并构建新的假病毒模型已被广泛应用于生命科学研究，科学家已经探索了出多种用于创建包膜型假病毒的包装系统，用于诸如埃博拉病毒(EBOV)， 马尔堡病毒(MARV) 和拉沙热病毒(LASV) 等新兴传染病(EID)的研究。 科研人员使用假病毒模拟抗体阻断病毒进入细胞的生物过程，检测抗体或血清对假病毒是否具有中和活性(假病毒通常经过改造以携带荧光素酶报告基因，使其进行定量分析时比对野生型病毒容易得多，而且已证明假病毒感染的细胞数量与报告基因表达成正比)。图5：假病毒包装过程-将荧光素酶和 gp64基因插入VSV的全长cDNA克隆中(代替G基因命名为 AG-Luc)。 gp64pv 和 VSVpv 是通过将 VSVAG/Luc-*G分别别时感染表达 GP64和 VSVG 的293T细胞而产生的。 由于病毒与假病毒颗粒较小，直径基本在20nm-300nm 之间，而根据新冠病毒电镜照片，其直径约为100nm。根据病毒颗粒的这一特性，低转速、低离心力情况下并不能使病毒颗粒沉降，需使用超速离心技术来进行病毒的分离。 而病毒载体的分离方式与病毒类似一当携带目的基因的病毒感染培养的细胞，而受感染的细胞生产新的同类病毒，并释放进入培养基中，再将新病毒重新采集并纯化。在此过程中产生的病毒载量、纯度和质量会直接影响后续转导的效率。高效可靠的离心方案有助于优化病毒载体纯化，例如：高速离心和超速离心能有效地将病毒颗粒从细胞和细胞碎片中分离出来，而分析性超速离心(AUC)则可以根据病毒衣壳密度(一种病毒载量衡量方式)，来识别和分离病毒颗粒。这能有效实现在转导前去除空病毒颗粒以及仅含部 分目标遗传物质的病毒颗粒。 点击观看如下视频了解病毒纯化流程： 视频： https：//beckman.wistia.com/medias/2bhxw22ird 想了解详细的病毒和假病毒分离方法及步骤，请关注下期内容《如何高效分离新冠病毒毒株与假病毒》，小贝将具体解析超离纯化病毒的实验方法，敬请期待。 点击获取又“新冠及其他病毒疫苗/载体文献检索列表" 自1947年第一台商用超速离心机发明以来，贝克曼库尔特离心技术已有70多年的历史。早在19世纪60年代，已有许多用户使用贝克曼离心机成功分离了多种病毒颗粒。截至现在，贝克曼超离已帮助客户分离纯化得到流感病毒、肝炎病毒、腺病毒、慢病毒等多种几乎覆盖所有类型的病毒样品。贝克曼庞大的用户群体已为研究人员储存发表了数以万计的病毒分离方法与文献，助力病毒研究的同时，也使贝克曼离心机成为了当之无愧的病毒分离专家。 ( 参考文献： ) 1..Xiuyuan Ou et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry andits immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat Commun. 2020 Mar 27；11(1)：1620. 2. Yuuki Kaname et al. Acquisition of Complement Resistance through Incorporation ofCD55/Decay-Accelerating Factor into Viral Particles Bearing Baculovirus GP64. JOURNALOF VIROLOGY， Apr. 2010， p. 3210-3219 Vol.84， No. 7 3..Qianqian Li et al. Current status on the development of pseudoviruses for envelopedviruses. Reviews in Medical Virology ： Vol 28，No1 新冠病毒引发的疫情已经在全球范围内爆发，目前确诊感染人数已经超过160万，并且这一数值还在持续增长中。在疫情爆发初期，我国科研战线迅速行动，在短时间内取得重大进展，其中最重要的是，科研人员不到一周时间就确定了新冠病毒的全基因组序列并分离得到了病毒毒株，及时向全球共享。那么为什么分离病毒毒株这么重要呢？