疫苗中含量检测方案(紫外分光光度)

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蛋白质及多糖的测定-紫外可见分光光度法 目标客户：疫苗研发、，企业 依据标准：中国药典2015版 检测方法简介： 《中国药典》2015版 3421通则 b型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 0731通则 蛋白质含量测定法 第二法福林酚法(1owry法) 第三法双缩脲法 第四法2，2'-联喹啉-4，4'-二羧酸法(BCA法) )第五法考马斯亮蓝法(Bradford法) 第六法紫外-可见分光光度法 详见如下附录 仪器配置： 目前我们涵盖紫外-可见范围的型号都能满足以上应用 我们主要推荐三款仪器。销售人员可以根据客户的经费情况和竞争对手情况，选择推荐。 紫外可见分光光度计 Biomate 160 高清晰触摸屏，本机控制，包括生命科学应用软件包紫外可见分光光度计 Evolution201性能优异，光源3年年修，符合21 CFRPart11安全软件，可做3Q认证 紫外可见分光光度计 Evolution260 性能优异，可变带宽，光源3年保修，适用于生命科学的应用模块(含以上药典方法)，符合21 CFR Part11 安全软件，可做3Q认证 如果有疑问，请咨询赛默飞世尔科技的销售经理或技术人员。 附录 3421 b 型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法 本法系依据可溶性糖经无机酸处理脱水产生糖醛(戊糖)或糖醛衍生物，生成物能与酚类化合物缩合生成有色物质，以此测定多糖的含量。 试剂(1)0.1%三氯化铁盐酸溶液准确称取三氣化铁(FeC13·6H20)0.1g，放入清洁 的试剂瓶内，加盐酸100ml，待溶解后置2一8°C冰箱保存。 (2)地衣酚(3，5-二羟基甲苯)乙醇溶液称取地衣酚lg，放入10ml量瓶中，加95%乙醇至10ml。临用前配制。 (3)25ug /ml核糖对照品溶液 测定法 量取1ml水，加人5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液，混匀后再加人0.4ml地衣酚乙醇溶液，混匀。水浴5分钟后置冰浴，在波长670nm处测定吸光度，作为空白对照。 先将供试品用水稀释至核糖含量不髙于25ug/ml，作为供试品溶液，量取1.0ml自“加入5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起，同法操作。 分别取核糖对照品溶液0.1m 1、0.2ml、0.4ml、0.6m 1、0.8ml、1.0m1于10ml试管中，每管依次加水0.9ml、0.8ml、0.6ml、0.4ml、0.2ml、0ml，自“加人 5ml 0.1%三氯化铁盐酸溶液”起，同法操作。 结果计算 以核糖对照品溶液的浓度对其相应的吸光度作直线回归，求得直线回归方程。将供试品溶液的吸光度代人直线回归方程，求出供试品溶液的核糖含量。 供试品多糖含量(ug/ml)=a*n/0.41 式中a为供试品溶液的核糖含量，，t ug/ml； n为供试品稀释倍数 0731 蛋白质含量测定法 第二法福林酚法(lowry法) 本法系依据蛋白质分子中含有的肽键在碱性溶液中与Cu 2+螯合形成蛋白质-铜复合物，此复合物使酚试剂的磷钼酸还原，产生蓝色化合物，同时在碱性条件下酚试剂易被蛋白质中酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸还原呈蓝色反应。在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法灵敏度高，测定范围为20一250ug。但对本法产生干扰的物质较多，对双缩脲反应 产生干扰的离子，同样容易干扰福林酚反应，且影响更大。如还原物质、酚类、枸橼酸、硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。 除另有规定外，按方法1操作；如有干扰物质时，除另有规定外，按方法2操作并需经方法学验证。 方法1： 试剂 碱性铜试液：取氢氧化钠10 g，碳酸钠50g，加水400ml使溶解，作为甲液；取酒石酸钾0.5g， 加水50ml使溶解，另取硫酸铜0.25g，加水30ml使溶解，将两液混合作为乙液。临用前，合并甲、乙液，并加水至500ml。 对照品溶液的制备：除另有规定外，取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每lml中含0.2mg的溶液。 供试品溶液的制备：照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定定：精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0. 6ml 、0.8ml、1.0ml(对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整)，分别置具塞试管中，各加水至1.Otnl，再分别加入碱性铜试液1.0 ml，摇匀，室温放置10分钟，各加人福林酚试液[取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1一16]4.0 ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在650mn的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。 方法2： 测定前将脱氧胆酸盐-三氯醋酸加人样品中，通过将蛋白质沉淀来去除干扰物质。这种方法也可用于将稀溶液中的蛋白质浓度。 试剂 试液A取1%氢氧化钠溶液200ml与5%碳酸钠溶液200ml混合，加水稀释至500ml。 试液B取2.98%二水合酒石石二钠溶液100ml与1.25%硫酸铜溶液100ml混合，加水稀释至250ml，临用新制。 试液C取戏液A与与液B 按50：1的比例混合，临用新制。 福林酚试液取福林试液中的贮备液(2mol/L酸浓度)1一2(所配得的福林酚试液应满足以下要求：取供试品溶液lml，加试液C5ml和配好的福林酚试液0.5ml，所得溶液的pH值应为10.3±0.3。若溶液pH值超出范围，应适当调整福林酚试液的稀释倍数)。 去氧胆酸钠试液取去氧胆酸钠适量，加水制成每lml中含1.5mg的溶液。 对照品溶液的制备 除另有规定外，取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品适量，加水分别制成每lml中含 0.00mg、0.0lmg、0.02mg、0.03mg、0.04mg、0.05mg的溶液(对照品溶液浓度可在本法测定范围内进行适当调整)。 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定法： 精密量取各对照品溶液1.0ml，分别置玻璃试管中，加人去氧胆酸钠试液0.1m1，涡旋混匀，室温放置10分钟，加人72%三氣醋酸溶液0.1ml，涡旋混匀，在3000g条件下离心30分钟，轻轻倒出上清液，用吸管将剩余液体移除。蛋白质沉淀用试液Clml复溶后，再加入试液C5ml，混匀，室温放置10分钟，加人福林酚试液0.5ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在750nm的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液1.0ml，同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。 本法系依据蛋白质分子中含有的两个以上肽键在碱性溶液中与Cu2+形成紫红色络合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用 比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法快速、灵敏度低，测定范围通常可达1一10mg。本法干扰测定的物质主要有硫酸铵、三羟甲基氨基甲烷缓冲液和某些氨基酸等。 试剂 双缩脲试液取硫酸铜1.5g、酒石酸钾钠6.0g和碘化钾5.0g，加水500ml使溶解，边搅拌边加人10%氢氧化钠溶液300ml，用水稀释至1000ml，混匀，即得。 对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每lml中含10mg的溶液。 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定法： 精密量取对照品溶液0.0ml、0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml(对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整)，分别置具塞试管中，各加水至1.0ml，再分别加人双缩脲试液4.0ml，立即混匀，室温放置30分钟，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在540mn的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法操作。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，即得。 第四法2，2'-联喹啉-4，4'二羧酸法(BCA法) 本法系依据蛋白质分子在碱性溶液中将Cu2+还原为Cu+，2，2'-联喹啉二羧酸 (BCA)与Cu+结合形成紫色复合物，在一定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法灵敏度较高，测定范围可达80一400ug。本法测定的供试品中不能有还原剂和铜螯合物，否则干扰测定 试剂： 铜-BCA试液 取2，2'-联喹啉-4，4'二羧酸钠lg，无水碳酸钠2g，酒石酸钠0.16g，氢氧化钠0.4g与碳酸氢钠0.95g，加水使溶解成100ml，调节pH值至11.25，作为甲液； 另取4%硫酸铜溶液作为乙液。临用前取甲液100ml，加入乙液2ml，混仨，即得。 对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每lml中含0.8mg的溶液 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本长一致)。 测定法： 精密量取对照品溶液0.0ml、0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5mK对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整)，分别置具塞试管中，各加水至0.5ml，再分别加人铜-BCA试液10.0ml，立即混匀，置37°C：水浴中保温30分钟，放冷，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，立即在562nm的波长处测定吸光度；；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定。从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀稀倍数，即得。 本法系依据在酸性溶液中考马斯亮蓝G250与蛋白质分子中的碱性氨基酸(精氨酸)和芳 香族氨基酸结合形成蓝色复合物，在一；定范围内其颜色深浅与蛋白质浓度呈正比，以蛋白质对照品溶液作标准曲线，采用比色法测定供试品中蛋白质的含量。 本法灵敏度高，通常可测定1一200ug 的蛋白质量。本法主要的干扰物质有去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等，供试品缓冲液呈强碱性时也会影响显色。 试剂： 酸性染色液取考马马亮蓝G2500.lg， 加乙醇50ml溶解后，加磷酸100ml，加水稀释至1000ml，混匀。滤过，取滤液，即得。本试剂应置棕色瓶内，如有沉淀产生，使用前需经滤过。 对照品溶液的制备除另有规定外，取血清白蛋白(牛)对照品或蛋白质含量测定国家标准品，加水溶解并制成每lml中含lmg的溶液。 供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备(蛋白质浓度应与对照品溶液基本一致)。 测定法： 精密量取对照品溶液0.0ml、0.01ml. 0.02ml、0.04ml、0.06ml、0.08ml、0.lm 1(对照品溶液取用量可在本法测定范围内进行适当调整)，分别置具塞试管中，各加水至0.1ml，再分别加人酸性染色液5.0ml，立即混匀，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，立即在595mn的波长处测定吸光度；同时以0号管作为空白。以对照品溶液浓度与其相对应的吸光度计算线性回归方程。另精密量取供试品溶液适量，同法测定，从线性回归方程计算供试品溶液中的蛋白质浓度，并乘以稀释倍数，上即得。 【附注】本法测定时不可使用可与染色物结合的比色皿(如石英比色皿)，建议使用玻璃比色皿或其他适宜材料的比色皿。 第六法紫外-可见分光光度法 本法系依据蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸等芳香族氨基酸，其在280nm波长处具最大吸光度，在一定范围内其吸光度大小与蛋白质浓度呈正比。 本法操作简便快速，适用于纯化蛋白质的检测，一般供试品浓度为0.2一2mg/ml。本法准确度较差，干扰物质多。测定法(2)适用于供试品溶液中存在核酸时的蛋白质测定。对照品溶液与供试品溶液的制备照各品种项下规定的方法制备。 测定法： (1)取供试品溶液，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在280nm的波长处测定吸光度，以吸收系数法或对照品比较法计算供试品中蛋白质的含量。 (2)取供试品溶液，照紫外-可见分光光度法(通则0401)，在280nm与260nm的波长处测定吸光度，按下式计算供试品中蛋白质的含量。 蛋白质浓度(mg/ml)=1.45*A280-0.74*A260 《中国药典》2015版3421通则b 型流感嗜血杆菌结合疫苗多糖含量测定法0731通则蛋白质含量测定法o 第二法 福林酚法 (1owry 法)o 第三法 双缩脲法o 第四法 2,2' -联喹啉 -4,4’ -二羧酸法 (BCA 法)o 第五法 考马斯亮蓝法 (Bradford 法）o 第六法 紫外 -可见分光度法