生物制药中研发、制备及质控过程检测方案(液质联用仪)

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「商业解决方案]WatersTHE SCIENCE OF WHAT'S POSSIBLE. 「商业解决方案] lan John Edwards 沃特世公司(美国马萨诸塞州米尔福德) 简介 针对特定疾病专门研发的生物药物能够极大改善广大患者的生活质量。然而，将新型治疗药物推向市场是一场花费高昂并且充满不确定性的持久战。保证安全性、疗效和产品质量是第一要务。生物药物本身就非常复杂，又具有各种异质性，这些异质性可能是人们为了疗效而有意增加的，也可能是生产和储存过程中意外产生的，还有可能通过体内生物修饰产生。虽然并非全部，但的确有一部分翻译后修饰或生物转化过程会影响生物药物的开发、生产，以及药物的安全性、疗效和整体产品质量。在整个药物研发周期的各个阶段，我们都必须鉴定、表征、控制和监测这些关键质量属性(CQA)。基于质谱技术(MS)的专用测定方法一直以来都扮演着越来越重要的角色。 生物制药涉及形状、大小各异并且复杂程度各不相同的一系列物质，包括寡聚核苷酸、肽、合成肽、治疗性蛋白、单克隆抗体(mAb)、融合蛋白、双特异性抗体、抗体偶联药物(ADCs)和CAR-T细胞(1)等等，该领域的发现有时真的令人难以置信。 例如，斯克里普斯研究所(Scripps Research Institute)近期宣布与Janssen Research &Development合作开发出了一种模拟中和抗体结合区的合成环肽，对流感(包括H5N1型禽流感病毒)有广谱免疫作用(2)。 相较于治疗性抗体，治疗性肽的开发、生产和给药更简单。FDA 会通过快速通道开发项目授予罕见病(例如短肠综合征)治疗药物“孤儿药”状态，例如Zealand Pharma的glepaglutide 治疗性肽。 其它例子还包括不少处于开发阶段的免疫疾病和肿瘤疾病治疗药物。近期，《科学》杂志上刊登了一篇政企合作发表的文章，其介绍了一种能够广泛中和HIV病毒的三重特异性抗体，该药由赛诺菲(Sanofi)制药公司生产，并且即将进入Ⅰ期临床试验(3)。最近， FDA批准了诺华(Novartis)公司的一款CAR-T细胞治疗新药，该药通过基因转移技术重构患者自身的T细胞，从而识别白血病肿瘤细胞表面启动细胞凋亡的特异性抗原(4)。这类药物正不断将医疗发展引向个体化医疗方向。 应对不确定性 如何才能在复杂生物药物的研发过程中成功降低审批的不确定性，怎样才能加快研发和审批进程?2014年，阿斯利康公司(AstraZeneca)发布了具有里程碑意义的研发生产率回顾报告，该报告指出，整个行业范围内，大部分药物研发失败都发生在II期临床试验阶段，比例极高的项目因药物安全性和疗效不达标而失败。 这种情况催生出新型的“5R”药物研发指导策略，要求研发项目拥有适当的靶标、组织、患者、安全性和商业潜力(5)。从药物研发生命周期一开始就将重点放在了解疾病机理和药物作用或毒性机理上。因此，现在人们开发新药时会使用能在开发早期报告靶标结合程度的功效生物标志物。为了降低下游功效的不确定性，如今我们在招募临床试验受试者时会进行患者分级，扩大受试者群体以覆盖与目标疾病有基因关联的人群。 目标产品特性(TPP)是指标化的药物开发计划一览表，用于增进开发商与监管机构之间的交流、降低药物开发后期失败的风险以及确保及时提供安全性和疗效数据。如FDA指南所述，TPP体现了“以终为始”的理念(6)。TPP详细描述了理化特性(例如氨基酸序列和翻译后修饰(PTM))等产品属性(PA)。通常在研究阶段后期，筛选临床试验候选药物之前进行药物表征。 在早期开发阶段，需要评估药物PA对生物活性、安全性、药代动力学(PK)-药效学(PD)特性以及免疫原性风险的影响，并标记出潜在的关键质量属性(pCQA)(7)。 国际细胞治疗协会(ISCT)会举办年度会议，邀请FDA生物制剂评价和研究中心(CBER)及其利利益相关机构共同探讨有关生物药物开发的具体问题。 值得注意的是，在2016年的上一届会议中，来自CBER组织和先进疗法办公室的产品审批人员Tom Finn介绍的内容推动了关键质量属性(CQA)在产品生命周期中的确定和应用-重点关注确保安全性和和效特性(8)。 可能影响药物安全性和疗效的PTM或生物转化过程(例如会影响抗原结合及效价的mAb互补决定区蛋氨酸氧化)也被归属为CQA。能够可靠地鉴定、表征、控制和监测CQA的分析方法是将药物研究与开发计划相结合的纽带。 在产品开发生命周期中，前面提到的TPP可能会演变为目标产品质量特性(QTPP)。试生产和临床前测试阶段的大量CQA管理工作都是重复的。如果在临床前研究中发现可能影响药物稳定性或疗效的PTM或体内生物转化，则可能需要优化产品或工艺，并在生产工艺开发过程中将其标记为CQA。反过来，在质量控制(QC)工作中，可能需要在下游监测多个CQA。 质谱技术在药物研发中的应用 生物制药产品中可能含有多种通过功能性PTM或修饰衍生而来的变体或衍生物，例如糖基化变体(mAb)或ADCs等。因此我们非常需要适用的技术用于表征和定量达到上述复杂程度的物质。液相色谱-质谱联用(LCMS)是一项成熟的生物制药表征技术，因为该技术能直接进行分子水平的定性和定量测定。该技术在其它领域的应用也越来越广泛，包括大分子药物代谢及药代动力学(DMPK)研究、工艺开发、生产、质量控制、上市后监管以及治疗药物监测等。药物发现研究也会应用先进的LC-MS技术(9)。 缩写 定义 生物转化 物质的转化，例如药物在体内的转化 关键工艺参数 (CPP) 特定的工艺参数，若该参数发生变化，会对关 键质量属性产生影响，因此需要对其进行监 控，以确保通过该工艺制造的产品质量达标 (ICH Q8 [R2]) 必须达到相应限值、范围或分布要求才能保证 关键质量属性 (CQA) 目标产品质量达标的物理、化学、生物学或微 生物学属性或特性(ICH Q8[R2]) 多属性监测 指能够通过单次分析定量测定多个产品和工艺 (MAM) 参数的分析方法 翻译后修饰 生物合成过程中或完成之后发生的肽或蛋白质 (PTM) 共价修饰 药物成分或药物产品对其目标用途的适用性。 质量 该术语涉及成分、效力和纯度等属性(ICH Q8 [R2]) 一种以可靠的科学技术和质量风险管理方案为 质量源于设计 基础，从预先设定的目标起步并且注重产品认 (QbD) 知和工艺控制的系统性产品开发方案(ICHQ8 [R2]) 目标产品质量 理想情况下为确保药物产品质量达标预计必须 特性 满足的质量特性汇总，以药物产品的安全性和 (QTPP) 疗效为依据制定(ICHQ8[R2]) 表1.生物制药研发领域的关键术语。 高分辨率率谱(HRMS)，尤其是四极杆飞行时间质谱(QTOF)是药物研发领域的一项成熟生物制药表征技术。借助TOF质谱固有的性能优势(例如高检测精度)，研究人员能够对mAb进行准确的糖基化分析(10)，还能定量测定ADCs的药物/抗体比率(DAR)-这两项都是非常重要的CQA(11)。 现代先进QTOF具备的质量分辨率、质量精度和灵敏度往往已经超出了肽图分析、完整蛋白质分析以及糖基化分析等常规应用的要求(12)。 快速获取信息并保证数据完整性的能力与常规仪器性能同样重要，因为高效、便捷地管理数据是整个行业的需求，这涉及跨生命周期不同阶段的信息传递，以及与受监管和不受监管利益相关方(包括战略伙伴)的对接。 在PK研究中，我们必须定量测定药物清除率。过去，人们采用配体结合试验(LBA)测定给药后的药物浓度。然而，LBA专属性较差，而且会产生交叉反应。使用某些试剂时， LBA方法还可能对蛋白质异构体或变体不敏感。生物转化引起的生物药物结构完整性变化会影响试剂与配体的结合，而因为药物免疫原性刺激而释放的抗药物抗体会导致真实药物浓度被低估(13)。MS等专属性更高且具备多重分析功能的替代技术在不受监管的生物分析中应用日益广泛，向监管部门提交申请时，这些技术被用作辅助分析技术，它们具有特定于目标用途的合适灵敏度和动态范围，并且拥有可直接定量的优势，能够有效提升结果可靠性并降低测定的不确定性。 在对灵敏度、准确度和精确度均有极高要求的蛋白质定量分析中，基于特征性肽段的串联四极杆质谱(TQMS)方法仍然是“黄金标准”(14，15)。经过验证的此类分析方法可用于常规分析，同时也是大规模研究和治疗药物监测的理想之选(16，17)。不过，高分辨率MS(HRMS)也可用于定量分析，尤其是在选择性不足而导致灵敏度受限的情况下，越来越多的研究人员开始转向利用高质量分辨率和准确质量数的优势(18)。HRMS还颇受方法开发人员的青睐。借助数据非依赖型采集或靶向MS/MS， 我们能够以高质量分辨率检测出所有肽碎片离子并据此选出“高专属性”通道，而这些通道可转换为TOF-多重反应监测(MRM)或TQMS等灵敏度更高的模式用于常规分析。与离子阱技术不同，四极杆飞行时间质谱仪对进入分析器的分子数量没有限很，因此可在高背景噪音下达到更低的定量下限(LLOQ)，尤其适合用于定量复杂基质中的生物治疗药物(19)。 基于特征性肽段的定量分析方法要求彻底酶解蛋白质并谨慎选择用于报告总蛋白质或目泪蛋白质变体的特征性肽段(20)。 然而，如果所选特征性肽段不能识别生物转化(例如内源性蛋白酶裂解或蛋白质部分降解)，就会增加分析的不确定性。相比之下，无需进行酶解的完整蛋白质分析可保留分子完整性，非常适合将所有蛋白质作为一个整体进行定量。相较于TQMS，分子量在约10~15kDa以上的蛋白质都可通过HRMS进行完整蛋白质水平的分析，这类分析包括蛋白质异构体分析(例如单克隆抗体糖型，△162 Da)。对于血浆这样的复杂基质，还可以采用免疫捕获技术。此外，也可以将蛋白质部分酶解为亚基，在保留一级结构的前提下进行完整分子定量，这类分析包括不同糖型的分析或ADC生物转化分析(例如有效负载水解， △18 Da)(21，22)。如果PTM或生物转化造成的质量变化较小，例如脱酰胺化(+1Da)， 则可彻底酶解所有蛋白质，然后在特征性肽段水平定量不同的酶解物(20)。此外，完整蛋白质分析还可用于测定与大型生物转化相关的变化，例如因融合蛋白的连接子区域发生未知蛋白酶裂解而导致蛋白质发生截断和分解代谢的情况。 HRMS是一项成熟的小分子代谢物鉴定技术，如今该技术越来越多地被DMPK研究人员用于大分子分解代谢及生物转化分析。因此，研究人员需要应用合适的信息学工作流程来追踪和定量肽和蛋白质生物治疗药物的清除情况，掌握相关的生物转化活动，尤其对于含有会影响药物体内稳定性、生物活性和安全性的非天然氨基酸和连接区域的分子，更需谨慎分析(23，24)。 质谱技术在药物开发中的应用 在生产、配送和储存过程中保持治疗性抗体的化学和结构完整性一直是药物开发领域面临的一大挑战。因此，明确蛋白质的结构-功能关系、确定CQA和CPP，以及开发有效的控制策略是贯穿药物开发过程的几大重点(7)。蛋白质治疗药物中的常见修饰-蛋氨酸氧化能够很好地说明这一点。在最近发表的一篇文章中， Janssen公司的研究人员借助强制降解研究、氢气交换(HDX)HRMS和结构建模成功区分了不同蛋氨酸残基处的氧化所产生的影响，为抗体治疗药物的CQA评估提供了非常有价值的信息(25). 确定CQA之后，开发有效的控制策略就成了确保成功实现优质药物商业化生产的关键。高通量的在线或离线分析工具对于构建工艺参数与产品质量属性之间的联系至关重要，这有助于我们掌握生产工艺、提升产品质量以及提高生产效率(26)。 除了确定CQA和CPP之外，还应该为QC分析开发并验证可靠的分析方法，为商业化生产做好准备。HRMS独有的多属性监测(MAM)功能使得该技术在质量控制领域潜力无限。最近， Janssen公司的研究人员发表了一种基于定量MS的亚基蛋氨酸氧化分析方法，该方法灵敏度高、稳定性强，而且通量远高于传统的肽图分析方法(27)。 在药物开发过程中，借助质量源于设计(QbD)理念可确定与产品质量、安全性和疗效相关的CQA。掌握这些CQA与药物生物活性、PK-PD特性、免疫原性以及稳定性之间的关系有助于我们制定控制策略。包括PTM(异构化、氧化、脱酰胺化和糖基化)在内的许多CQA都需要进行监测。在早期开发阶段， CQA可通过研究级HRMS进行表征，但进入生产阶段之后，就需要使用能可靠应用于QC环境、成本较低并且更加便于操作的质谱检测器来监测和定量相同的质量属性。MedImmune的团队最近发表了一种“使用四极杆质谱检测器选择性监测和定量治疗性单克隆抗体PTM的多属性监测方法”，该方法符合国际协调会议(ICH)指南要求，被应用于产品表征和稳定性监测(28)。 随着生物药物越来越复杂以及人们越来越依赖于LC-MS等功能强大的生物分析策略来表征、控制和监测这些药物，生产商要尽力获取有关安全性、疗效和产品质量的分析数据，监管机构则要发布有关风险及优势评估以及新药审批标准的指南，两者之间不断博弈。可以肯定的一点是，在这个逐渐实现个体化医疗的时代，生物制药企业一直在提高分析技术精密度，而LC-MS和信息学技术也将持续发展，以满足行业需求(29)。 ( 参考文献 ) ( 1. https：//www.amgenscience.com/the-shape-of-drugs-to-come/ ) 2. https：//www.scripps.edu/news/ ( 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