蛋白质中蛋白质鉴定检测方案(液相色谱仪)

智能文字提取功能测试中

thermoscientific 热线800 8105118电话 400 6505118www.thermofisher.com 使用ProSightPD进行top-down蛋白质鉴定 胡墨，黄敏赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词： Top-down蛋白质组学，ProSightPD，完整蛋白鉴定， Orbitrap超高分辨质谱 前言 当前，蛋白质组学主要有两类研究策略，即基于分析酶解后多肽的bottom-up(自下而上)蛋白质组学和直接研究完整蛋白的top-down(自上而下)蛋白质组学。由于完整蛋白质的分离和串联质谱解析相对于多肽难度更大，top-down蛋白质组学的进展相对缓慢。随着MabPac RP等分离完整蛋白的高性能色谱柱的出现及Orbitrap超高分辨质谱技术的不断发展，快速批量获取完整蛋白质的高质量串联质谱图逐渐成为可能。赛默飞世尔科技业界领先的top-down蛋白质组学数据分析软件ProSightPD也使研究者可以采用类似bottom-up蛋白质组学的方法，高通量鉴定top-down串联质谱图。本文的工作中，我们以大肠杆菌核糖体的蛋白质组成分析为例，对top-down蛋白质组学技术以及ProSightPD工作流程进行了考察。 实验材料和方法 大肠杆菌核糖体(E. coli 70S ribosome， NEB PN P0763S)经冰醋酸沉淀核糖体RNA后得到核糖体蛋白。 液相色谱质谱联用(LC-MS/MS) 高效液相色谱仪： Thermo Scientific Ultimate 3000；色谱柱： MabPac RP， 2.1 mm x 5 cm；柱温：80摄氏度；流动相： A：0.1% Formic acid in water； B： 0.1% Formic acid inacetonitrile；梯度：10%B 1 min，10%-50% B in 30 min， 50%-80%Bin 5min， 80%B1min， 80%B-10%B in 1 min，10%B3min；流速：0.25 mL/min 质谱仪： Thermo Scientific Orbitrap Fusion Lumos； intact pro-tein mode；分辨率设置：：一级120，000@m/z 200，imicroscans5，二级120，000@ m/z 200， microscans 5； Max IT ： full MS250 ms， full MS/MS 246 ms； 母离子扫描范围： m/z 400-2000；子离子扫描范围： start from m/z 200； Data-dependent MS/MS： top 5； Isolation window： 3 Da； Dynamic exclusion： 40s； 阶梯碰撞能量：15%，20%，25% HCD； 数据分析 采用Proteome Discoverer 2.2.0.388的ProSightPD1.1模块进行top-down蛋白质组学数据分析，具体工作流程见正文。Precursor mass tolerance： 100 Da；；Fragment mass tole-rance： 10 ppm Top-down蛋白质组学研究的对象不再是酶解后的多肽，而是完整的蛋白质。因此， top-down蛋白质组学更适合进行蛋白翻译后修饰和蛋白相互作用等方面的研究(图1)。由于完整蛋白质的串联质谱图中，碎片更多，且有大量的多电荷碎片，因此进行常规多肽鉴定的Sequest等搜索引擎不适合进行完整蛋白质鉴定。Top-down蛋白质组学需要专门的数据分析软件和工作流程。 图1. Bottom-up 和top-down 蛋白质组学对比 ProSightPD是Proteome Discoverer的一个模块，专门用于top-down蛋白质组学数据的高通量解析，可分析蛋白质混合物的数据依赖采集(DDA)液质联用实验结果。在本工作中，我们选择大肠杆菌核糖体，采用Orbitrap Fusion Lumos的HCD碎裂方式进行高通量top-down蛋白质组学数据采集。 2大肠杆菌核糖体蛋白的top-down蛋白质组学数据 大肠杆菌核糖体的结构如下图2所示。该复合物由55个蛋白和核糖体RNA组成，总分子量约为2302 kDa1。通过冰醋酸沉淀可去除核糖体RNA，即得到核糖体蛋白的混合物。 图2.大肠杆菌核糖体结构示意图。 采用MabPac RP色谱柱，可有效对完整蛋白进行色谱分离。图3A为5ug大肠杆菌核糖体蛋白的top-down LC-MS总离子流色谱图。Orbitrap质谱出色的灵敏度和分辨率保证了对多个不同丰度的蛋白同时进行单同位素峰分辨(图3B)；高质量的MS/MS谱图则是top-down蛋白质鉴定的良好基础(图3C)。 图3.大肠杆菌核糖体蛋白的LC-MS/MS谱图。A. 5 pg核糖体蛋白的TIC图； B.12.08 min的质谱全扫描谱图，右上角小图为局部放大，可见多种不同蛋白质在此时共流出；C. 典型的top-down MS/MS质谱图，可见丰富的多电荷碎片。 3 ProSightPD进行top-down蛋白质组学数据分析实例 Top-down蛋白质组学实验得到的串联质谱图碎片相对于多肽谱图复杂很多，且有大量的多电荷碎片。ProSightPD软件采用多种解卷积算法，可分析不同采集方法的top-down蛋白质组学数据。由于大部分核糖体蛋白的分子量均小于30 kD， 在本工作中我们选择了high-high workflow (MS与MS/MS分辨率均为120，000)，并采用HCD碎裂完整白白。典型的数据分析流程如下图4。 图4. ProSightPD进行top-down蛋白质鉴定的典型流程 仅用5ug核糖体蛋白， ProSightPD从大肠杆菌蛋白数据库中鉴定50个蛋白质，覆盖了大肠杆菌核糖体蛋白复合物中的90%以上。这个结果充分展现了Orbitrap质谱出色的灵敏度和动态范围。 表1. ProSightPD进行top-down蛋白质组学鉴定的核糖体蛋白中排名前20位的蛋白列表 Accession Description PSMs MW [kDa] Gene Symbol KEGG Pathways P0A7K2 50S ribosomal protein L7/L12 106 12.3 rplL Ribosome P0A7N9 50S ribosomal protein L33 38 6.4 rpmG； EAMY_RS17670 Ribosome P0A7U7 30S ribosomal protein S20 16 9.7 rpsT Ribosome P0AG59 30S ribosomal protein S14 16 11.6 rpsN Ribosome P62399 50S ribosomal protein L5 15 20.3 rplE； AB182_RS27795 Ribosome POADY7 50S ribosomal protein L16 14 15.3 rplP Ribosome P0A7T7 30S ribosomal protein S18 12 9 rpsR； DDA3937_RS17220 Ribosome P0A7S3 30S ribosomal protein S12 11 13.7 CSK29544_RS06375； rpsL； Ribosome POA7J3 50S ribosomal protein L10 10 17.7 rplJ Ribosome P0A7M2 50S ribosomal protein L28 10 9 rpmB Ribosome POA7U3 30S ribosomal protein S19 10 10.4 rpsS； AL524_RS00870 Ribosome POAG51 50S ribosomal protein L30 9 6.5 rpmD Ribosome P60624 50S ribosomal protein L24 9 11.3 CSK29544_RS06470； rplX Ribosome P0A7J7 50S ribosomal protein L11 9 14.9 rplK Ribosome P0A7R1 50S ribosomal protein L9 8 15.8 rpll Ribosome P68679 30S ribosomal protein S21 8 8.5 rpsU； DDA3937_RS02955 Ribosome P0A7K6 50S ribosomal protein L19 7 13.1 rplS Ribosome POA7M9 50S ribosomal protein L31 7 7.9 rpmE Ribosome P0A7S9 30S ribosomal protein S13 7 13.1 rpsM Ribosome POA7W7 30S ribosomal protein S8 6 14.1 rpsH； AL524_RS25290 Ribosome ProSightPD还提供了丰富的可视化界面展示top-down蛋白质组学结果(图5)。解卷积之后的谱图匹配列表(图5A)表明，谱图中的主要碎片均可与蛋白序列结构碎片得到良好匹配(质量偏差小于10 ppm)。碎片离子的序列覆盖图(图5B)说明， HCD碎裂产生了相当丰富的结构信息(53%的残基均有碎片离子信号)。 A Vz(10^3) B ⑤ITKDQ]rlI]E]A]vlAlAlMiLs1vlvilplvlvle]LLils]A26]M E E]K F1G]v]s1A AlAlAlvlAlv1A1AlG1PV ELA A ELEIKTE FLDLV I L KLALALG ANKVAVIKAVRGA7576 TGLGLKE A KDLLLVLELSLALPAALKLEGVSK100101 LDLDLA ELA L KLKLA LLELETALG ALELvLELV K 图5. ProSightPD的top-down蛋白鉴定结果展示。A. 解卷积之后的碎片离子匹配图。B.碎片离子的序列覆盖图。 Top-down 蛋白质组学的一个显著优势是在完整蛋白层次进行翻译后修饰的研究(图6)。对于50S ribosomal protein L33， 通过串联谱图我们可以精准定位其N末端的丙氨酸上有单甲基化修饰，与文献报道一致2。在这个修饰位点的鉴定中， Orbitrap质谱丰富的碎片信息和精确的质量测定起到了至关重要的作用。重果采用Orbitrap Fusion Lumos质谱进行top-down蛋白质组学研究，我们还可以使用CID， ETD， EThcD， UVPD等多种碎裂方式联合分析，进一步提高碎片离子的覆盖率，从而解析更加复杂的翻译后修饰。ProSightPD可自动识别多种碎裂方式的串联谱图，采用对应的碎片离子类型解析top-down串联质谱图。 POA7N9， 50S ribosomal protein L33， precursor mass error： 1.16 ppmAKLGI R EKlIlKlLlvlsls1AlG1T1G1H1F1Y1T1TLTLK N 2526KRTKP ELKL]ELLK1K1F1D1P]V V R Q H]VLI YLKLE505lAlK]r1K 图6. ProSightPD进行top-down蛋白鉴定精准确定翻译后修饰位点。通过y53碎片离子可精确定位化基化翻译后修饰位点应为N-末端的丙氨酸。 结论 使用ProSightPD可对复杂蛋白质混合物进行自动化的高通量top-down蛋白质组学研究。仅用5 pg蛋白，即可鉴定到大肠杆菌核糖体蛋白复合物中超过90%的组成蛋白。得益于Orbitrap质谱的高分辨率和高质量串联谱图， ProSightPD可精准测定蛋白质序列、蛋白翻译后修饰类型及位点。这一工作流程可用于蛋白复合物的组成研究和翻译后修饰研究等，与bottom-up和native MS等蛋白质组学技术互为补充，提供更加全面的蛋白质结构信息。 ( [2] Wittmann-Liebold B， et al. FEBS Lett.， 68， 1 1 5. ) ( 仅用于研究目的。不可用于 诊 断目的。 ◎ 2018 Thermo Fisher Scientific Inc. 保 留 所有权利 。 所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除 非 另有指明 。 ) 当前，蛋白质组学主要有两类研究策略，即基于分析酶解后多肽的bottom-up（自下而上）蛋白质组学和直接研究完整蛋白的top-down（自上而下）蛋白质组学。由于完整蛋白质的分离和串联质谱解析相对于多肽难度更大，top-down蛋白质组学的进展相对缓慢。随着MabPac RP等分离完整蛋白的高性能色谱柱的出现及Orbitrap超高分辨质谱技术的不断发展，快速批量获取完整蛋白质的高质量串联质谱图逐渐成为可能。赛默飞世尔科技业界领先的top-down蛋白质组学数据分析软件ProSightPD也使研究者可以采用类似bottom-up蛋白质组学的方法，高通量鉴定top-down串联质谱图。本文的工作中，我们以大肠杆菌核糖体的蛋白质组成分析为例，对top-down蛋白质组学技术以及ProSightPD工作流程进行了考察。使用ProSightPD可对复杂蛋白质混合物进行自动化的高通量top-down蛋白质组学研究。仅用5 µg蛋白，即可鉴定到大肠杆菌核糖体蛋白复合物中超过90%的组成蛋白。得益于Orbitrap质谱的高分辨率和高质量串联谱图，ProSightPD可精准测定蛋白质序列、蛋白翻译后修饰类型及位点。这一工作流程可用于蛋白复合物的组成研究和翻译后修饰研究等，与bottom-up和native MS等蛋白质组学技术互为补充，提供更加全面的蛋白质结构信息。