PH梯度中双特异性抗体检测方案

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thermoscientific 新型离子交换色谱柱在pH梯度下检测不同类型的双特异性抗体 史俊霞，金琦芸，赛默飞世尔科技(中国)有限公司色谱质谱部 关键词 双特异性抗体， ProPac Elite WCX，MAbPac SCX-10 RS ，CX-1 pH Buffer 摘要 2.实验部分 本文使用新型离子交换色谱柱ProPac Elite WCX 5 pm 4.0mmX150mm色谱柱和CX-1Buffer缓冲液，进行pH梯度高分辨率分析非对称型双特异性抗体和对称型的IgG类抗体，使用MAbPac SCX-10 RS 5um 4.6 mmX50 mm色谱柱和CX-1 Buffer缓冲液，进行pH梯度高分辨率分析片段型双特异性抗体。解决了等电聚焦电泳和其他色谱分离模式不能分离的杂质异构体。给双特异性抗体的QC方法控制提供参考。 双特异性抗体( Bispecific Antibody) 因其能同时特异性结合两种抗原或者两个表位的抗体分子，可以发挥两种单抗联合的协同作用，成为当下最热门的新药研发方向之一。其作用机制主要包括介导免疫细胞杀伤、双靶点信号通路阻断以及促进蛋白形成功能性复合体三种。这些优异的特性，使得国内外制药巨头纷纷布局该产线，目前比较常见的双抗结构有：非对称的IgG型双抗(图一)，对称的IgG型双抗(图二)和片段型双抗(图三)，结构的复杂性和多样性，使得表征和制备该类样品困难重重，本文采用新型离子交换色谱柱ProPac Elite WCX色谱柱和线性CX-1pH Buffer缓冲液高分辨率分析非对称的IgG型双抗和对称的IgG型双抗，使用MAbPac SCX-10 RS 5um 4.6 mmX50mm色谱柱和CX-1 Buffer缓冲液分析片段型双抗，方案可用于相关双抗药物质量研究表征和QC 放行。 图一非对称IgG型双抗 图二对称IgG型双抗 图三片段型双抗 2.1仪器，色谱柱与试剂 1.1.1Ultimat 3000 Bio RS 1.1.2 Vanquish Flex UHPLC 1.1.3 ProPac Elite WCX5pm 4.0 mmX150mm( Thermo Fisher公司 P/N302972) 1.1.4MAbPac SCX RS 5um4.6mmX50 mm( Thermo Fisher公司 P/N 082674) 1.1.5j超纯水 1.1.6 CX-1pH缓冲液 250mL (P/N 085349) 2.2样品信息 2.2.1 样品1：非对称IgG型双抗 样品2：对称IgG型双抗 样品3：片段型双抗 2.2.2样品制备方法：样品原始浓度进样 2.3色谱和检测器条件 2.3.1 pH梯度条件下弱阳离子交换柱分离非对称型双抗 色谱柱： ProPac Elite WCX 5pm 4.0 mmX150 mm 流动相： A： CX-1 Buffer A稀释10倍(pH5.6) B： CX-1 Buffer B稀释10倍(pH10.2) 梯度条件： 时间 A% B% ( min) -8 60 40 0 60 40 15 45 55 15.1 0 100 17 0 100 流速：0.8mL/min 样品：非对称IgG型双抗 6 mg/mL 进样体积：2pL 检测波长：UV280mm 仪器： Ultimat 3000 Bio RS 2.3.2 pH梯度条件下弱阳离子交换柱分离对称型双抗 色谱柱： ProPac Elite WCX 5um 4.0 mmX150 mm 流动相：A： CX-1 Buffer A稀释10倍(pH5.6) B： CX-1 Buffer B稀释10倍(pH10.2) 梯度条件： 时间 A% B% ( min) -8 60 40 0 60 40 5 30 70 15 0 100 17 0 100 柱温：室温 流速：0.8mL/min 样品：对称IgG型双抗 6mg/mL 进样体积：10pL 检测波长： UV280nm 仪器： Vanquish Flex UHPLC 2.3.3 pH梯度条件下强阳离子交柱柱分离片段型双抗 色谱柱： MAbPac SCX RS 5pm 4.6mmX50mm 流动相： A： CX-1 Buffer A稀释10倍+50 mmol/L NaCl(pH5.6) B： CX-1 Buffer B稀释10倍+50 mmol/L NaCI(pH10.2) 梯度条件： 时间 A% B% (rmin) -4 95 5 0 95 5 18 75 25 18.1 0 100 20 0 100 柱温：室温 流速：0.5mL/min 样品：片段型双抗 3 mg/mL 进样体积：10pL 检测波长： UV 280nm 仪器： Vanquish Flex UHPLC 3.1.1非对称lgG型双抗分析结果 如图四所示本次分析的非对称IgG型双抗在ProPac Elite WCX 色谱柱上，使用CX-1 Buffer在 pH梯度下洗脱样品，可以得到两个酸性峰和两个碱性峰杂质。 图四非对称IgG型双抗pH梯度分离谱图 3.1.2 对称IgG型双抗分析结果 如图五所示本次分析的对称IgG型双抗在ProPac Elite WCX 色谱柱上，使用CX-1 Buffer在pH梯度下洗脱样品，可以得到两组酸性峰，组一含有8个酸性组分，组二含有3个酸性组分，总计11个酸性峰和2个碱性峰杂质。从此结果看该样品的酸峰组成比一般的单抗更复杂多样。 图五对对IgG型双抗pH梯度分离谱图 3.1.3片段型双抗分析结果 如图六所示本次分析的片段型双抗在MAbPac SCX-10 RS 色谱柱上， 在CX-1Buffer+50 mmol /L NaCI体系下，洗脱样品，可以得到7个酸性峰和6个碱性峰杂质。 图六片段型双抗pH梯度+盐梯度分离谱图 4.实验结论 双特异性抗体作为一类双靶点药物，是近年来最热门的研发领域之一，因生产工艺的差异使得其在电荷异构体分析中更具有挑战性，常规的盐梯度方法很难较好的分离出酸碱变异体，本 热线8008105118电话4006505118www.thermofisher.com 仅用于研究目的。不可用于诊断目的。 ◎2020 Thermo Fisher Scientific Inc. 保留所有权利。 ：文使用商品化的CX-1 Buffer在弱阳离子交换柱ProPac Elie WCX和强阳离子交换柱MAbPac SCX-10 RS 柱子上可以实现较好的分离，且该方法只需要将流动相稀释10倍，或者添加少量的NaCl就可以实现较好的分离。本文中研究的非对称IgG型双抗对称IgG型双抗和片段型双抗在该方法下都可以实现酸碱变异体的较好的分离，是一种快速方便的双特异性抗体电荷异构体分析平台方法。该方法为双特异性抗体的表征和质量控制提供了新的解决方案。 ( 参考文献 ) ( [1] 双特异性抗体药物研究进展 中国医药生物技术李锋 ) ( 2] F inney， A . F.(2019) Bispecific Antibodies： N ew Strategies andCase Studies in Antibody Engineering& Therapeutics 2019 SanDiego， CA ) ( [3] MAbPac SCX-10 Product Manual The r mofisher Scientific Company ) ( [4] ProPac Elite WCX Product M a nual Th e rmofisher Scientific Company ) ( [5] CX-1 p H Gradient B u ffer Product Manual T h ermofisher Scientific Company ) Thermo FisherSCIENTIFIC 所有商标均为 Thermo Fisher Scientific Inc. 及其子公司的资产，除非另有指明。 双特异性抗体作为一类双靶点药物，是近年来最热门的研发领 域之一，因生产工艺的差异使得其在电荷异构体分析中更具有 挑战性，常规的盐梯度方法很难较好的分离出酸碱变异体，本 文使用商品化的CX-1 Buffer在弱阳离子交换柱ProPac Elie WCX 和强阳离子交换柱MAbPac SCX-10 RS 柱子上可以实现较好的 分离，且该方法只需要将流动相稀释10倍，或者添加少量的 NaCl就可以实现较好的分离。本文中研究的非对称IgG型双抗， 对称IgG型双抗和片段型双抗在该方法下都可以实现酸碱变异 体的较好的分离，是一种快速方便的双特异性抗体电荷异构体 分析平台方法。该方法为双特异性抗体的表征和质量控制提供 了新的解决方案。