蛋白提取液中动物组织全蛋白质组检测方案(液相色谱仪)

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thermoscientificAN_C_LCMSMS_1_201704Y 讨论400 650 5118(支持手机用户)A Thermo Fisher Scientific Brand 不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组 鉴定的影响 259 前言 目前利用高分辨质谱仪能够对细胞的全蛋白质组进行深度覆盖，鉴定细胞内接近全蛋白质组的蛋白数目[1-3，同时对于多种生物学过程中所涉及的翻译后修饰也能进行深度的鉴定和定量。质谱仪的能力和样品前处理是影响实验结果的两大重要因素，本文主要分析样品前处理过程中不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组鉴定的影响。 细胞裂解和蛋白质提取一般采取机械和物理两种方法相结合。传统的机械裂解如研磨、反复冻融、超声与溶液内剪切等对细胞进行破碎，为了提高蛋白提取效率，机械裂解的同时加入表面活性剂或变性剂，破坏细胞及细胞器脂膜同时增加蛋白溶解度。常用的表面活性剂分为离子型、两性离子型和非离子型三大类，最常添加的非离子型表面活性剂有 Triton X-100 和NP-40二者可使蛋白质最小化变性；离子型的表面活性剂 SDS， 可完全溶解细胞膜，蛋白提取效率最高，但蛋白质完全变性失活。常用的蛋白变性剂如尿素和盐酸胍，能够断裂蛋白氢键，使蛋白发生不同程度的变性，同时增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度。因此根据实验目的、样品类型以及样品量选择合适的机械裂解与蛋白提取液，将有助于提高蛋白质组研究的深度。 本文工作分析4种不同蛋白提取液 SDT(2% SDS，100 mM DTT， 100 mM Tris-HCL， PH7.6)、M-PER( ThermoFisher 哺乳动物细胞蛋白提取试剂盒，专利去垢剂，25 mM bicine， pH7.6)、T-PER (ThermoFisher哺乳动物组织蛋白提取试剂盒，专利去垢剂，25mMbicine， 150 mM sodium chloride，pH7.6) 以及 RIPA(50 mM Tris/HCI， 150 mM NaCI，1%NP40，0.25%sodium deoxycholate，11 mM EDTA， pH7.6)对灌流后的小鼠肝脏组织全蛋白质组鉴定的影响。同时分析组织匀浆后结合探头超声对蛋白鉴定的影响。 1.样品处理 分别使用4种不同蛋白提取液提取灌流后的小鼠肝脏全蛋白，为保证蛋白酶解时酶的最佳活性，因此需将蛋白样品中的去垢剂去除，其中 SDT、M-PER、T-PER 采取 FASP超滤方法去除同。RIPA 蛋白提取液中的 NP-40 在临界微团浓度(CMC， critical micelle concentration ) 以上时会形成分子量约为 90 kD 的聚合物微团，不适合超滤法去除，因此采用丙酮沉淀的方式去除去垢剂。酶解后的肽段用高PH反相肽段预分级试剂盒(P/N Thermo84868)进行手工予分级，实验设计及流程见图 1。 B 图1.不同蛋白提取液对样品处理流程(A.蛋白提取及酶解过程； B.使用 Pierce High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kit 对肽段进行分级过程)注：由于SDS易产生泡沫不易去除，因此 SDT buffer 实验时先采用 1*PBS匀浆； M-PER 和 T-PER 均直接在裂解液中匀浆，在裂解液中匀浆可直接变性蛋白，使得蛋白质不易降解，是更合适的选择。另外只有 SDT buffer 需要加热，因为 SDT buffer 中有 DTT， 高温更易打开二硫键， 而 T-PER， M-PER 中无原剂，加热意义不大 高效液相色谱仪： EASY nLC1000 ( ThermoFisher Scientific ) 分析柱：自制C18纳升级喷针柱，长度 15 cm，内径75 um， 粒径3 um 流动相： A，0.1%甲酸/水；B，0.1%甲酸/乙腈 梯度：按照试剂盒说明共洗脱8个组分；为了提高鉴定效率，并且增加预分级方法和质谱前 Nano 液相分离的正交性将组分1与组分7合并，组分2与组分8合并；由于各个组分间肽段疏水性不同，因此液相梯度稍有不同，如表1； 3.质谱采集方法 质谱仪： Q Exactive HF ( ThermoFisher Scientific ) 离子源： Nanoflex；离子极性：正离子； 喷雾电压：2.0 kV； 离子传输管温度：3000C； S-Lense：60%；分辨率：一级60k，二级30k； AGC：一级3e6二级1e5； MaxIT：一级20 ms 二级45ms； 碰撞能量： 27%(NCE ) 1.比较组织匀浆后探头超声对蛋白质组鉴定的影响 经典的组织蛋白提取方法中为了将细胞裂解完全，在匀浆、沸水浴后再进行探头超声超，我们因此比较使用 T-PER 裂解时探头超声对蛋白提取效果的影响。为了减少整个实验过程其他因素的干扰，所有步骤平行操作，且在质谱鉴定时不同裂解液的同一组分依次被检测。比较两组样品的Protein Groups、Peptide Groups、PSM、Search Input 的数目如表2，结果显示超声后对蛋白的鉴定有增加作用，但增加数目有限。二者鉴定蛋白种类的覆盖度达84%如图2A，具有高度的一致性。因此综上所述，对组织蛋白提取时，组织匀浆后的探头内部超声对蛋白鉴定结果影响不大。同时评估手工高PH反相肽段预分级的效果如图2B，结果显示约有62%的肽段仅在一个组分中被鉴定到，有着不错的分离效果，且其分离效果与样品种类密切相关。 SDT RIPA M-PER T-Per 非超声 T-Per 超声 Protein Groups 6410 6171 6089 5418 5497 Peptide Groups 51170 49604 44299 39739 40597 PSM 126438 119335 111240 100598 103276 Search input 300995 304598 298519 295632 295708 2.比较不同蛋白提取液对全蛋白质组鉴定的影响 不同蛋白提取液鉴定结果(表2)显示， SDT 的蛋白鉴定结果整体好于其他蛋白提取液。不同提取液鉴定蛋白种类的覆盖度如图3，不同提取液间有一定的互补性；并对鉴定到的蛋白进行亚细胞成分定位(GO功能分析)如表3所示， SDT 提取组织全蛋白时，对任意亚细胞成分蛋白的提取效果都好于其他裂解液或水平相当。但值得注意的是 SDT 虽然具有很好的全蛋白提取效果，但由于其含有强去垢剂 SDS， 使蛋白变性失活，因此 SDT 蛋白提取液不适用于后续做与活性相关的实验，如免疫共沉淀；而其他几种则是较温和的蛋白提取液， M-PER、T-PER 中都含有特殊去垢剂，同样会使得蛋白质变性，不能用于 Co-IP 和酶活性实验。本次实验中的 RIPA 蛋白提取液含有 NP40 主要能溶解细胞膜，但对核膜溶解能力有限；此外脱氧胆酸 钠可溶解核膜，但会使得蛋白质在一定程度上变性，因此如果准备做胞浆蛋白的 C0-IP，蛋白提取液不能加入脱氧胆酸钠；如果准备做细胞核蛋白质的相互作用，那么需要优化 buffer 体系中脱氧胆酸钠的含量，溶解核膜和维持蛋白质 complex native 状态是天平的两端，需要针对不同的实验要求来优化，总而言之，研究细胞核蛋白质的相互作用是当前生物化学和蛋白质组学研究中比较有挑战性的课题。 SDT M-PER RIPA T-PER 1 T-PER 2 extracellular matrix protein 58 45 46 34 32 cytoskeletal protein 259 248 248 226 231 transporter 263 237 249 210 217 transmembrane receptor regulatory/adaptor protein 21 19 19 19 20 transferase 467 450 450 410 403 oxidoreductase 352 347 345 333 328 lyase 86 85 80 82 81 cell adhesion molecule 71 63 66 53 53 ligase 165 161 158 157 155 nucleic acid binding 814 751 761 673 688 signaling molecule 177 158 167 136 139 enzyme modulator 464 433 442 410 401 calcium-binding protein 140 131 131 120 115 defense/immunity protein 78 66 77 60 60 hydrolase 569 536 564 490 499 transfer/carrier protein 176 165 163 152 148 membrane traffic protein 175 159 167 154 153 transcription factor 199 180 182 158 164 chaperone 86 90 90 83 82 cell junction protein 39 33 34 34 31 structural protein 33 28 26 26 27 storage protein 6 5 6 6 6 isomerase 91 91 88 87 85 receptor 167 141 150 119 118 通过这部分工作的摸索，我们得知对于 SDT 裂解液裂解细胞或组织时我们会采用探头超声来进一步促进细胞破碎，并且打断 DNA 来降低样品粘度。而对于 M-PER， T-PER，RIPA等裂解液，我们发现探头超声对蛋白质鉴定数量的提高很有限，并且此时我们需要采用非常温和的超声条件，以免蛋白质变性后产生大量絮状沉淀。 四种全蛋白提取液中， SDT 的提取效果最好，但不适用于下游活性蛋白相关实验。在进行蛋白质浓度测定时由于SDT 裂解液中含有 SDS 和 DTT， 因此 Bradford 法和 BCA方法不适用，而应选择去垢剂和还原剂均兼容的荧光法测定蛋白质浓度。各种裂解液中含有的去垢剂均会影响胰蛋白酶活性，并且对质谱分析产生很大影响，因此均需要在蛋白质样品酶解前除去。不同的去垢剂也均有不同的去除方法，包括常用的超滤和丙酮沉淀等。 在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时，我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法，才能保证我们后续实验顺利进行，并且获得可信的结果。 ( [1] Wilhelm M， Schlegl J， Hahne H， et al. Mass-spectrometry-based draft of the human proteome.[J].Nature， 2014，509(7502)：582. ) ( [2] Kim M S， Pinto S M ， Getnet D， et al. A draft map of thehuman proteome.[J]. Nature， 2014， 509(7502)：575-581. ) ( [3] Feng Z， Yu L， Ficarro S B， et al. Genome-scale ProteomeQuantification by DEEP S EQ M a ss Sp e ctrometry[J].Nature Communications， 2013， 4(3)：2171. ) ( [4] Bantscheff M， Hopf C， Kruse U ， e t al. P roteomics-based strategies in k inase drug d i scovery.[J]. E rnstSchering Foundation Symposium Proceedings， 2007，2007/3(3)：1. ) ( [5] Garavito R M，Ferguson-Miller S. D etergents as toolsin membrane biochemistry.[J]. Journal of BiologicalChemistry， 2001， 276(35)：32403-32406. ) ( [6] Wisniewski JR， Zougman A， Nagaraj N， et al. U n iversalsample preparation method for proteome analysis.[J].Nature Methods，2009，6(5)：359-362. ) ( [7] Jacek R. W isniewski， N agarjuna N a garaj， AlexandreZougman， et a l. Brain phosphoproteome obtained by aFASP-based method r e veals p lasma membrane proteintopology.[J]. Journal of Proteome Research， 2010，9(6)：3280. ) Orbitrap 组学俱乐部 赛默飞小分子质谱应用技术群 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com 全国服务热线：8008105118 thermoscientific     目前利用高分辨质谱仪能够对细胞的全蛋白质组进行深度覆盖，鉴定细胞内接近全蛋白质组的蛋白数目，同时对于多种生物学过程中所涉及的翻译后修饰也能进行深度的鉴定和定量。质谱仪的能力和样品前处理是影响实验结果的两大重要因素，本文主要分析样品前处理过程中不同蛋白提取液对动物组织全蛋白质组鉴定的影响。    细胞裂解和蛋白质提取一般采取机械和物理两种方法相结合。传统的机械裂解如研磨、反复冻融、超声与溶液内剪切等对细胞进行破碎，为了提高蛋白提取效率，机械裂解的同时加入表面活性剂或变性剂，破坏细胞及细胞器脂膜同时增加蛋白溶解度[5]。常用的表面活性剂分为离子型、两性离子型和非离子型三大类，最常添加的非离子型表面活性剂有 Triton X-100 和 NP-40 二者可使蛋白质最小化变性；离子型的表面活性剂 SDS，可完全溶解细胞膜，蛋白提取效率最高，但蛋白质完全变性失活。常用的蛋白变性剂如尿素和盐酸胍，能够断裂蛋白氢键，使蛋白发生不同程度的变性，同时增大疏水氨基酸残基在水相中的溶解度。因此根据实验目的、样品类型以及样品量选择合适的机械裂解与蛋白提取液，将有助于提高蛋白质组研究的深度。    通过这部分工作的摸索，我们得知对于 SDT 裂解液裂解细胞或组织时我们会采用探头超声来进一步促进细胞破碎，并且打断 DNA 来降低样品粘度。而对于 M-PER，T-PER，RIPA 等裂解液，我们发现探头超声对蛋白质鉴定数量的提高很有限，并且此时我们需要采用非常温和的超声条件，以免蛋白质变性后产生大量絮状沉淀。    四种全蛋白提取液中，SDT 的提取效果最好，但不适用于下游活性蛋白相关实验。在进行蛋白质浓度测定时由于SDT 裂解液中含有 SDS 和 DTT，因此 Bradford 法和 BCA 方法不适用，而应选择去垢剂和还原剂均兼容的荧光法测定蛋白质浓度。各种裂解液中含有的去垢剂均会影响胰蛋白酶活性，并且对质谱分析产生很大影响，因此均需要在蛋白质样品酶解前除去。不同的去垢剂也均有不同的去除方法，包括常用的超滤和丙酮沉淀等。    在进行各种各样纷繁复杂的蛋白质组学实验时，我们需要根据我们具体的实验目的来选择合适的裂解液和裂解方法，才能保证我们后续实验顺利进行，并且获得可信的结果。