生物样品中汞形态检测方案(液相色谱仪)

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返回目录环 境 化 学ENVIRONMENTAL CHEMISTRY第32卷 第11期2013年 11月Vol. 32， No. 11November 2013 返回目录环 境 化 学32卷2220 安捷伦 (Agilent)环境科学专栏 微波辅助萃取-高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法联用测定生物样品中的汞形态 张 兰1* 陈玉红 王英峰 施燕支 (1.首都师范大学分析测试中心，北京，100048；2.安捷伦科技(中国)有限公司，北京，100102) 摘 要 建立了微波辅助萃取、高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用(HPLC-ICP/MS)测定生物样品中汞形态的方法.采用醋酸铵/L-半胱氨酸缓冲盐及甲醇体系组成的流动相按一定比例进行梯度洗脱，并结合了ICP/MS 的时间分辨采集优化程序分析二介汞、甲基汞、乙基汞、苯基汞等4种汞形态.根据所建立的 HPLC-ICP/MS 方法分析了鱼肉及人发标准参考物质中的汞形态，样品前处理采用盐酸-半胱氨酸体系作为萃取剂、微波辅助萃取法.对于鱼肉和人发标准参考物质，6次平行样测定结果的相对标准偏差(RSD%)均小于5%，且测定值与标准值较吻合.该方法前处理简单、样品提取效率高、分析时间短、精密度及重现性理想，极适用于生物样品中汞形态的快速萃取与分析. 关键词 微波辅助萃取， HPLC-ICP/MS联用， 生物样品，汞形态. 汞的主要存在形态有无机汞、甲基汞、乙基汞和苯基汞及其它有机汞，环境中存在最多的是无机汞和甲基汞.汞的毒性主要依赖于所存在的化学形态及浓度，即使剂量极低亦可累积致毒.有机汞的毒性强于无机汞，而其中甲基汞是毒性最大的有机汞化合物，主要侵害神经系统尤其是中枢神经系统，且此类损害害不可逆的.苯基汞对皮肤、眼睛和呼吸道亦有中毒刺激作用，会使皮肤产生过敏反应，无机汞易通过生物甲基化作用形成甲基基.鉴于不同形态态化合物的毒性差异，有必要采用高灵敏度、快速的形态分析方法测定生物样品中汞形态. 目前，气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)与毛细管电泳(CE)作为主要的高效分离技术，与原子荧光光谱(AFS)、原子吸收光谱(AAS)、电感耦合等离子体-原子发射光谱(ICP/AES)以及电感耦合等离子体质谱(ICP/MS)等高灵敏度的检测技术联用已成为分析各种汞形态的主要手段.其中，HPLC-ICP/MS 联用技术具有选择性与灵敏度最佳、接口简单、应用范围广、可以多检测器串联、前处理过程简便且有利于保持待测样品的原始形态不变等优点，在元素的形态价态分析应用较为广泛010-12.汞形态分析的前处理方法主要有酸解溶剂萃取、碱消化萃取、酸挥发预富集、固相萃取(SPE)法、冷阱捕集法，固相微萃取法(SPME)13-21. 本文以鱼肉和人发标准参考物质为研究对象，在已有文献酸式萃取的基础上，建立了微波辅助萃取、盐酸-半胱氨酸体系作为萃取剂进行样品前处理，理采用 HPLC-ICP/MS法测定了生物样品中形形态的分析方法.微波辅助萃取的样品提取效率高，操作简单，而所建立的 HPLC-ICP/MS 方法在8 min 内即可完全分离分析4种汞形态，大大缩短了样品的分析时间，极适合于生物样品中汞形态的快速萃取分析要求. 实验部分 1.1 仪器与试剂 Agilent 7500ce ICP-MS，配备有机进样系统与加氧通道； Agilent 1200 HPLC；微波辅助萃取仪(CEM MARSX).高速冷冻离心机(BECKMAN COULTER Allegra TM 64RCentrifuge). 醋酸铵(优级纯)；L-半胱氨酸(优级纯)；甲醇(色谱纯)；二价汞(Hg’*)、甲基汞(Me-Hg)、乙基乙(Et-Hg)、苯基汞(Ph-Hg)标准溶液.超纯水：电阻率18.2 MQ·cm. 汞标准参考物质：鱼肉中的甲基汞标准参考物质 GBW10029(中国计量科学研究院)，人发标准参考物质 GBW07601(地矿部物化探研究所) ( *通 讯联系人：T e l：( 010 ) 6890 2 6 95-802； E-ma i l ： zhan g l an12 3123@163 . com ) 1.2 实验条件 色谱条件：Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 色谱柱，4.6 mmx150 mm，5 u m；保护柱 Zorbax Eclipse Plus C18，4.6 mm×12.5 mm.流动相：A相为10 mmol·L-醋酸铵/0.12%L-半胱氨酸，氨水调节pH=7.5，经0.45 pm 滤膜过滤；B相为甲醇.流动相流速为1.0 mL·min-；进样量5一100 pL.梯度洗脱程序如表1. 表1 梯度洗脱程序 t/min A/% B/% 0.00 92.0 8.0 2.50 92.0 8.0 2.51 55.0 45.0 6.50 55.0 45.0 6.51 92.0 8.0 ICP-MS条件：入射功率1550 W；采样深度8.0 mm；载气流速：0.6Lmin.玻璃同心雾化器；石英雾化室，半导体控温于-5℃；Pt采样锥和截取锥；有机进样专用炬管，1.0 mm 内径；高有机相时的0，/Ar 混合气(20：80)加入量约10%；采样模式：Time program. 同位素：Hg202，积分时间0.5s. 1.3样品前处理 准确称尔0.2000g样品置于酸煮、洗净的聚四氟乙烯-四氟乙烯(PTFE-TFE)中压消解罐中，加入萃取剂，按萃取程序加热萃取：最高功率1200 W，反应 10 min，温度80℃，保持60 min. 萃取程序结束后，冷却至常温，打开密闭消解罐，样品萃取液转移至干净的15 mL 塑料离心管，4000 r*min转速于4℃离心10 min， 过 0.45 um滤膜过滤，上机待测.随同样品进行空白试验. 2结果与讨论 2.1样品前处理方法选择与优化 生物样品中的甲基汞分析前处理方法常采用碱消解-振荡法进行样品提取，再用二氯甲烷进行反萃￥1，20，其过程较繁琐，费时费力且回收率低；有文献14，18，21]采用5-6mol·L左右的 HCl 作为萃取剂，超声辅助萃取法进行样品提取.微波萃取是利用微波能来提高萃取效率的一种最新发展起来的新技术.与超声、浸提等萃取方法相比，微波萃取具有简便、快速、萃取效率高、重现性好、污染与损少少等优点，因此本实验选择微波萃取作为提取生物样品——鱼肉和人发标准参考物质的前处理方法.实验采用5mol·L-的盐酸并加入一定量的L-半胱氨酸作为提取剂，加入L-半胱氨酸目的在于提高甲基汞的提取效率.文中以鱼肉中的甲基汞标准参考物质为例，详细考察了萃取剂中L-半胱氨酸的浓度对结果的影响.结果表明，当半胱氨酸的浓度为3%5%时提取效率较高(表2).因此最终采用5 mL 5 mol·L=HCl-1mL 3%L-半胱氨酸的体系进行微波辅助萃取. 表2L-半胱氨酸浓度对鱼肉标准参考物质中甲基甲萃取浓度的影响(ug*kg-) Hg Me-Hg Et-Hg Ph-Hg 5 mol·L-HCl+0%L-半胱氨酸 ND 712.8 ND ND 5 mol·L-HCl+1%L-半胱氨酸 ND 731.4 ND ND 5 mol·L-HCl+2%L-半胱氨酸 ND 759.9 ND ND 5 mol·L-HCl+3%L-半胱氨酸 ND 800.1 ND ND 5 mol·L-HCl+4%L-半胱氨酸 ND 756.4 ND ND 5 mol·L-HCl+5%L-半胱氨酸 ND 795.2 ND ND ND，未检出. 2.2 LC与 ICP-MS 条件的选择 对色谱条件(色谱柱、流动相中缓冲盐乙酸铵的浓度、L-半胱氨酸的浓度、缓冲盐pH等)以及质谱条件均进行了优化”.在优化的条件下，采用 Plus C18柱进行二价汞、甲基乙、乙基汞及苯基汞等4种汞形态的分离.流动相以10mmol·L-乙酸铵/0.12%L-半胱氨酸并加入一定量的甲醇作为淋洗液.考虑到苯基汞保留时间较长，采用梯度洗脱程序提高有机相比例以改善苯基汞的洗脱能力.4种汞化合物的保留时间、峰高，拖尾因子均令人满意.此外，根据梯度淋洗过程中引入 ICP 中的基质差异， ICP-MS 的采集方式采用与液相梯度洗脱程序相匹配的时间分辨采集程序(Timeprogram)，可有效保证在流动相基质变化时各种汞形态的信号响应最高. 2.3 标准样品分析 为验证方法的准确性，按照所建立的微波辅助萃取、HPLC-ICP/MS 法对鱼肉及人发标准参考物质中的汞形态进行分 析，两种标准物质中的汞形态谱图图别别参图1.每种样品平行处理6里，计算得到相对标准偏差(RSD%)均小于5%，结果见表3.此外，结果表明，该鱼肉标准样品中仅含甲基汞，人发样品中则含无机汞和甲基基. 图1 鱼肉与人发中的汞形态色谱图 表3 鱼肉和人发标准参考物质的4种汞形态分析(ugkg，n=6) Hg+ Me-Hg Et-Hg Ph-Hg 总汞 Found Certified Found Certified Found Certified Found Certified Found Certified 1 ND / 795.9 840±30 ND / ND / / / 2 ND / 796.6 ND / ND / / / 3 ND / 791.2 ND / ND / / / 鱼肉 4 ND / 800.1 ND / ND / / / 5 ND / 810.2 ND / ND / / / 6 ND / 802.1 ND / ND / / / 平均 ND 799.4 ND ND RSD/% 0.81 1 212.4 / 171.8 / ND / ND / 384.2 360±50 2 211.9 / 181.4 / ND / ND / 394.3 3 201.9 / 184.8 / ND / ND / 386.7 人发 24 225.4 / 172.7 / ND / ND / 398.1 5 226.9 173.7 N D / N D 390.8 6 217.5 171.6 ND N D 398.5 平均 216.0 175.9 N D N D 391.9 RSD/% 4.33 3.23 结论 本文采用微波辅助萃取法进行样品前处理，并利用 HPLC-ICP-MS 联用技术建立了鱼肉、人发标准物质中汞形态的分析方法.在前处理方法和色谱、质谱实验条件优化下，选择5 mol·L-盐酸和3%半胱氨酸作为萃取剂， Plus C18 柱主离汞化合物形态.根据所建立的方法，以鱼肉和人发标准参考物质为研究对象验证方法的准确性，平行样品分析相对标准偏差(RSD)均小于5%(n=6)，精密度良好.鱼肉、人发标准物质中态形态的测定结果表明，鱼肉标准参考物质主要含有甲基汞，人发标准物质含有无机和甲基汞.本方法前处理简单、样品提取效率高、分析时间短，大大满足生物样品中汞形态的快速提取与分析的要求. 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