293T细胞裂解液酶切肽段中人蛋白质组定量分析检测方案(气相色谱仪)

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thermoscientific Q Exactive HF 实现高通量人蛋白质组定量分析 周岳张晓夕赛默飞世尔科技(中国)有限公司 关键词 Q Exactive HF， DDA， DIA， 293T，定量蛋白质组学 娄据非依赖性的扫描模式( data-independent acquisition， DIA)是近几来来发展的一种新的质谱数据采集方式。DIA扫描模式中，超高分辨质谱对特定质量范围内的所有母离子进行碎裂，采集所有母离子的碎片离子，并快速地依次扫描相邻的母离子窗口内的所有碎片离子。DIA 的数据中包含了所有碎片离子的保留时间和强度信息。用非常小的质量偏差窗口(如10 ppm)目标性地抽提同一肽段的多个子离子，计算子离子的强度，就能对该肽段进行鉴定和定量。DIA 定量相比传统的基于母离子强度的 DDA定量有选择性好，定量准确等优点，所以 DIA 成为定量蛋白组学新的热门发展方向)。 Q Exactive HF 是赛默飞世尔科技在2014年的 ASMS 上推出的全新静电场轨道阱超高分辨质谱仪(3.4)。QExactiveHF 采用了分段式四极杆技术(Advanced QuadrupoleTechnology， AQT) 使离子传输效率至少提高了2倍；超高场 Orbitrap 技术，提高了 Orbitrap 扫描速度，在15000分辨率时，二级谱图的扫描速度是 18 Hz。这两项技术提高了Q Exactive HF 进行 DDA、DIA 数据的采集能力。本文用Q Exactive HF 质谱，170 min 色谱梯度对293T细胞蛋白质组进行 DIA 定量分析，考察Q Exacive HF DIA 定量的能力。 实验条件 实验材料和方法 293T细胞裂解液酶切肽段，样品中加入iRT 肽段用于保留时间校正， DDA 和 DIA数据采集，每种采集模式平行进行三次次术重复， DDA 用于构建谱图库， DIA用于定量分析。 NanoLC 高效液相色谱仪： Thermo Scientific Easy-nLC 1000； 色谱柱： analytical column (C18， 3 um， 100A， 75umx20 cm)；流动相： A： 0.1% Formic acid in water；B： 0.1%Formic acid in Acetonitrile；梯度：3%-8% B in 4 min，8%-30% B in 153 min， 30%-90% B in 10 min， 90%-90%B in 3 min；流速：300 nL/min 质谱分析 ( DD 模式： ) ( 质谱仪： Thermo Scientific Q Exactive HF；喷雾电压：2.1kV；毛细管温度：275℃； S-lens： 60 % ；碰撞能量：27% HC D ；分辨率设置： 一级60，000@m/z 200， ， 二级 15，000@m/z 200； M ax IT： full MS 20ms， full MS/MS 45 ms； 母离子扫描范围： m/z 350-150 0 ；子离子扫描范围： start from m/z 120； Data-dependent MS/MS： T op 20；Isolation window： 1.6 Da； dynamic exclusion： 35s ) 质谱仪l：：Thermo Scientific Q Exactive HF；喷雾电压： 2.1 kV；毛细管温度：275℃； S-lens：60%；碰撞能量：27%HCD； 分辨率设置：一级60，000@m/z200，二级30，000@m/z 200； Max IT： full MS 20 ms， full MS/MS45 ms； 母离子扫描范围： m/z 350-1200；子离子扫描范围：start from m/z 120；窗口数目：40；隔离窗口：20 Da 数据处理 DDA数据采用 Proteome Discoverer 2.1进行蛋白鉴定，数据处理流程： Sequest HT 搜库引擎；；人蛋白数据库( uniprot human_201309)，母离子质量偏差：10 ppm；碎片离子质量偏差：0.02Da；固定修饰：半胱氨酸烷基化(+57.021 Da)；动态修饰： 甲硫氨酸氧化(+15.995Da)； 酶： trypsin；漏切位点：2；peptide FDR<0.01；protein FDR<0.01 DIA数据采用 Spectronaut软件进行 DIA蛋白定量：1)建立谱图库： Proteome Discoverer 2.1数据检索生成的pdresult 文件导入 Spectronaut建立谱图库； 每个肽段最少含有3个碎片离子，最多含有6个碎片离子；碎片离子的 m/z 范围是 300-1800；2)原始文件格式转化：将Raw 文件格式转换成htrms 格式的文件；3) DIA 数据峰抽提，导入 DIA 数据，设定谱图库，控制 q<0.01。 实验结果 1.DDA 鉴定结果以及谱图库建立 取 293T细胞裂解液酶切肽段约1 ug 进行 170 min 色谱梯度的 DDA 数据采集，为了获得较全面的谱图库， DDA实验平行进行三次技术重复。3组 DDA 数据用 ProteomeDiscoverer 2.1 进行数据检索，控制 peptide FDR<0.01，protein FDR <0.01.一共鉴定到90，202个肽段，6496个蛋白，平均一个蛋白鉴定到15个肽段， 显示 Q ExactiveHF 进行蛋白鉴定实验能获得较好的蛋白序列覆盖率。 将 Proteme Discoverer 2.1检索生成的 pdresult文件导入Spectronaut 建立谱图库，该谱图库格式是 kit 文件，用于Spectronaut DIA 峰抽提。在建立谱图库时，筛选每个肽段至少包含3个碎片离子，最多包含6个碎片离子，碎片离子的 m/z 300-1800。谱图库中一共含有656，678个碎片离子，87，743个肽段，6，270个蛋白c 相同的293T 样品用于 170 min 色谱梯度的 DIA 数据采集，并且平行进行3次技术重复，考察 DIA 的定量能力和CV。图1是3次 DIA 实验的 Base peak 图，保留时间和响应均一致，显示出较好的色谱稳定性。较好的色谱稳定性是获得可信非标记定量结果的前提。 3次 DIA 实验分别能够抽提到 77，695个肽段，6，028个蛋白；77，673个肽段，6，042个蛋白；77，556个肽段，6，019个蛋白(表1)。DIA 能够鉴定到谱图库中88%的肽段，96.7%的蛋白，显示 DIA具有较高的分析通量。三次 DIA实验肽段的 median CV 7.5%， 蛋白的 median CV4.3%，显示出 DIA 具有非常好的重现性以及定量的准确性。DIA 提峰的质量精度在经过校正后能够达到3 ppm，显示 Orbitrap 具有较高的质量精度。DIA 数据处理的方法就是对目标肽段的碎片离子进行色谱峰抽提， Orbitrap 能将质量抽提窗口缩小到3ppm，那么基于 Oribtrap 的 DIA就能获得较好的选择性(图2)。 TPA ( Total Protein Amount)方法可以进行每个蛋白丰度的估计(5)， 假设总的上样量是1 pg。通过计算，丰度最高的蛋白是 Histone H B type 1-L，柱上绝对浓度是4631pmol。丰度最低的蛋白是Sister Chromatid cohesionprotein DCC1， 柱上绝对浓度是6 fmol。丰度最低和丰度最高的蛋白相差5个数量级， 显示 Orbitrap 具有非常宽的动态范围。 结论 相叫于传统的 DDA 定量， DIA 作为新的 label free 定量方法，具有重现性好、受干扰小、定量准确等优点。通常 DIA 采取 1D LC-MS/MS 的分析方法，因此获得较多的定量蛋白数目是非常大的挑战。目前文献报道的 DIA/SWATH能定量到的人细胞系的蛋白数目在2000-4000 左右，远远低于SILAC，TMT 等标记定量的通量(6。本文基于最新的 Q Exactive HF 质谱， 以 293T细胞裂解液为模型考察 DIA 定量蛋白的能力。首先对293T 细胞裂解液酶切肽段建立谱图库，鉴定到87743个肽段，6270个蛋白，然后用 DIA 对 293T 细胞裂解液酶切跳段进行定量分析。使用170 min 的梯度， DIA就能定量到77000个肽段，6000个蛋白，显示出基于 Orbitrap 的 DIA 具有非常高的定量通量。 图1.三次 DIA 定量分析的 base peak 图 表 1.三次 DIA定量到的 293T 肽段和蛋白结果 293T DIA1 DIA_2 DIA 3 Total Peptides 77695 77673 77556 82231 Proteins 6028 6042 6019 6148 图2.Spectronaut DIA 峰抽提校正前和校正后的质量精度 图3. DIA定量的动态范围 Orbitrap组 学俱乐部 赛默飞小分子质谱应用技术群 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 www.thermofisher.com ( 参考文献： ) ( 1. Muntel， J .； Xuan， Y.； Berger， S . T.； Reiter， L .； B achur，R.； Kentsis， A.； Steen， H.， A dvancing U r inary P r oteinBiomarker Discovery b y Data-Independent Acquisitionon a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer. JProteome Res 2015， 1 4， (11)，4752-62. ) ( 2. B ruderer， R.； Bernhardt， O. M. ； Ga n dhi， T.； Miladinovic，S. M.； Cheng， L.Y . ； Messner， S . ； Ehrenberger， T . ；Zanotelli，V.； Butscheid， Y . ； Escher， C.； Vitek， O . ； Rinner，O.； R eiter， L.， Extending t h e l i mits of quantitativeproteome p r ofiling with data-independent a cquisitionand a pplication to acetaminophen-treated three- dimensional l iver microtissues. Mol CellProteomics 2015，14，(5)，1400-10. ) 3. Scheltema， R. A.； Hauschild， J. 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SCIENTIFIC 支持手机用户) 实验条件实验材料和方法293T 细胞裂解液酶切肽段，样品中加入 iRT 肽段用于保留时间校正，DDA 和 DIA 数据采集，每种采集模式平行进行三次技术重复，DDA 用于构建谱图库，DIA 用于定量分析。相同的 293T 样品用于 170 min 色谱梯度的 DIA 数据采集，并且平行进行 3 次技术重复，考察 DIA 的定量能力和CV。图 1 是 3 次 DIA 实验的 Base peak 图，保留时间和响应均一致，显示出较好的色谱稳定性。较好的色谱稳定性是获得可信非标记定量结果的前提。3 次 DIA 实验分别能够抽提到 77,695 个肽段，6,028 个蛋白；77,673 个肽段，6,042 个蛋白；77,556 个肽段， 6,019 个蛋白（表 1）。DIA 能够鉴定到谱图库中 88% 的肽段，96.7% 的蛋白，显示 DIA 具有较高的分析通量。三次 DIA 实验肽段的 median CV 7.5%，蛋白的 median CV 4.3%，显示出 DIA 具有非常好的重现性以及定量的准确性。DIA 提峰的质量精度在经过校正后能够达到 3 ppm， 显示 Orbitrap 具有较高的质量精度。DIA 数据处理的方法就是对目标肽段的碎片离子进行色谱峰抽提，Orbitrap 能将质量抽提窗口缩小到 3 ppm，那么基于 Oribtrap 的 DIA 就能获得较好的选择性（图 2）。TPA（Total Protein Amount）方法可以进行每个蛋白丰度的估计（5）， 假设总的上样量是 1 µg。通过计算，丰度最高的蛋白是 Histone H2B type 1-L，柱上绝对浓度是 4631 pmol。丰度最低的蛋白是 Sister Chromatid cohesion protein DCC1，柱上绝对浓度是 6 fmol。丰度最低和丰度最高的蛋白相差 5 个数量级，显示 Orbitrap 具有非常宽的动态范围。实验结果1. DDA 鉴定结果以及谱图库建立取 293T 细胞裂解液酶切肽段约 1 µg 进行 170 min 色谱梯度的 DDA 数据采集，为了获得较全面的谱图库，DDA 实验平行进行三次技术重复。3 组 DDA 数据用 Proteome Discoverer 2.1 进行数据检索，控制 peptide FDR<0.01， protein FDR < 0.01，一共鉴定到 90,202 个肽段，6496 个蛋白，平均一个蛋白鉴定到 15 个肽段，显示 Q Exactive HF 进行蛋白鉴定实验能获得较好的蛋白序列覆盖率。将 Proteme Discoverer 2.1 检索生成的 pdresult 文件导入Spectronaut 建立谱图库，该谱图库格式是 kit 文件，用于Spectronaut DIA 峰抽提。在建立谱图库时，筛选每个肽段至少包含 3 个碎片离子，最多包含 6 个碎片离子，碎片离子的m/z 300-1800。谱图库中一共含有 656,678 个碎片离子，87,743 个肽段，6,270 个蛋白。