培养细胞中的线粒体提取

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培养细胞中的线粒体提取一、介绍    分离线粒体的原理：从组织或细胞中分离线粒体的关键步骤，大致相同：（1）通过机械和/或化学手段使细胞破裂，（2）低速离心以除去杂质和较大的细胞器，随后以较高的速度离心，以分离收集的线粒体。 此种线粒体分离方法可以满足大多数应用。 下述步骤详述提取步骤，旨在提供能够获得尽可能高产量和酶活性的线粒体。二、实验方案（详见6操作步骤）1、冻融法弱化细胞膜，以5.0mg / ml悬浮于试剂A中，置于冰上10分钟。2、使用杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer 匀浆，损坏细胞膜3、SPIN 1: 4°C温度下1000g离心力，离心10分钟，收集上清液#1. 重复收集上清液#24、SPIN 2: 4°C温度下12,000g离心力，离心15分钟，弃上清，保留沉淀。5、加入C试剂，蛋白酶抑制剂，使用涡旋振荡器重悬沉淀，分装-80°C保存6、线粒体测定：蛋白质浓度，OXPHOS活性，Western Blot三、关键试剂和仪器1、试剂A 50ml2、试剂B 50ml3、试剂C 10ml4、杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)5、涡旋混合器VORTEX30006、低温高速离心机BIOCEN 22R四、存储条件试剂A/B/C， 4°C存储五、其他试剂和仪器1、双蒸水2、蛋白酶抑制剂（PI）3、BCA蛋白质分析4、2ml离心管5、 天平等实验室常规设备六、操作步骤线粒体制备遵循三个简单的步骤：细胞破裂，离心去除杂质和大的细胞器，离心分离线粒体。 以下是从培养的人类细胞中制备线粒体的指导原则。 试剂和样品应尽可能冷藏。 建议使用4 x 150 mm的融合细胞平板（约4x107个细胞）。1、收集细胞：在贴壁细胞的情况下，它们可以用细胞提取器收集，并通过在1000g离心沉淀。 每个平板通常产生2mg全细胞蛋白质。 这可通过蛋白质测定来检查。2、使用冻融发弱化细胞膜3、按照5mg蛋白加入1ml试剂A量进行计算，在2ml离心管中重悬细胞4、冰上放置10min损坏细胞膜：5、将细胞转入预冷的杜恩斯研磨器WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)中。.6、使用LOOSE杵，匀浆30次7、转移匀浆液到2ml离心管中.SPIN 1:8、 4°C温度下1000g离心力，离心10分钟9、收集上清液#1.10、加入试剂 B 重悬沉淀，加入体积与第3步等同.11、重复损坏细胞膜和 SPIN1中的 第8步.12、收集上清液，记作(SN) #2，丢弃沉淀13、充分混合 #1 & #2, 加到2ml离心管中，如果超过2ml 请均分到两个离心管中SPIN 2:14、4°C温度下12,000g离心力，离心15分钟15、弃上清，保留沉淀16、使用500μl试剂C，重悬沉淀，同时加入蛋白酶抑制剂17、分装-80°C保存备用.七、常见问题分析 问题 可能引起原因 解决方法 线粒体离心沉淀很少 没有充分将细胞破碎 增加匀浆次数 大量的细胞色素C 细胞过度溶解/细胞不新鲜 减少匀浆次数/选取新鲜细胞 线粒体纯度低 存在污染 降低SPIN2离心力到6000g培养细胞中的线粒体提取 一、介绍 分离线粒体的原理：从组织或细胞中分离线粒体的关键步骤，大致相同：(1)通过机械和/或化学手段使细胞破裂，，((2)低速离心以除去杂质和较大的细胞器，随后以较高的速度离心，以分离收集的线粒体。此种线粒体分离方法可以满足大多数应用。7下述步骤详述提取步骤，旨在提供能够获得尽可能高产量和酶活性的线粒体。 二、实验方案(详见6操作步骤) 1、冻融法弱化细胞膜，以5.0mg/ml悬浮于试剂A中，置于冰上10分钟。 2、使用杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer 匀浆，损坏细胞膜 3、SPIN 1： 4℃温度下1000g离心力，离心10分钟，收集上清液#1.重复收集上清液#2 4、、SPIN 2：4℃温度下 12，000g 离心力，离心15分钟，弃上清，保留沉淀。 5、加入C试剂，蛋白酶抑制剂，使用涡旋振荡器重悬沉淀，分装-80℃保存 6、线粒体测定：蛋白质浓度， OXPHOS 活性， Western Blot 三、关键试剂和仪器 1、试剂A 50ml 2、试剂B 50ml 3、试剂C 10ml 4、7杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer(2ml) 5、涡旋混合器 VORTEX3000 6、低温高速离心机 BIOCEN 22R 四、存储条件 试剂 A/B/C，14℃存储 五、其他试剂和仪器 1、双蒸水 2、蛋白酶抑制剂(PI) 3、BCA蛋白质分析 4、、2ml 离心管 5、天平等实验室常规设备 六、操作步骤 线粒体制备遵循三个简单的步骤：细胞破裂，离心去除杂质和大的细胞器，离心分离线粒体。以下是从培养的人类细胞中制备线粒体的指导原则。。试剂和样品应尽可能冷藏。。建议使用4x150 mm 的融合细胞平板(约4x107个细胞)。 1、收集细胞：在贴壁细胞的情况下，它们可以用细胞提取器收集，并通过在 1000g 离心沉淀。每个平板通常产生2mg全细胞蛋白质。。这可通过蛋白质测定来检查。 2、使用冻融发弱化细胞膜 3、按照 5mg 蛋白加入1ml试剂A量进行计算， 在2ml离心管中重悬细胞 4、冰上放置 10min 损坏细胞膜： 5、将细胞转入预冷的杜恩斯研磨器 WHEATON Dounce Homogenizer(2ml)中。. 6、使用 LOOSE 杵，匀浆30次 7、转移匀浆液到 2ml离心管中. SPIN 1： 8、 4℃温度下 1000g离心力，离心10分钟 9、收集上清液#1. 10、加入试剂B重悬沉淀，加入体积与第3步等同. 11、重复损坏细胞膜和 SPIN1 中的第8步. 12、收集上清液，记作(SN)#2，丢弃沉淀 13、充分混合#1& #2， 加到2ml离心管中，如果超过2ml 请均分到两个离心管中SPIN 2： 14、44℃温度下 12，000g离心力，离心15分钟 15、弃上清，保留沉淀 16、使用500pl试剂C，重悬沉淀，同时加入蛋白酶抑制剂 17、分装-80℃保存备用. 七、常见问题分析 问题 可能引起原因 解决方法 线粒体离心沉淀很少 没有充分将细胞破碎 增加匀浆次数 大量的细胞色素C 细胞过度溶解/细胞不新鲜 减少匀浆次数/选取新鲜细胞 线粒体纯度低 存在污染 降低 SPIN2 离心力到6000g