利用LUMiSizer®稳定性分析仪系统地研究剪切能的输入与产胞外多糖的嗜热链球菌沉积特性的关系 （系列一）

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利用LUMiSizer®稳定性分析仪系统地研究剪切能的输入与产胞外多糖的嗜热链球菌沉积特性的关系 （系列一）近年来，能够产生胞外多糖(EPS)的发酵剂的重要性显著增加，例如几种乳酸菌(LAB)。在发酵乳制品中，EPS影响产品粘度和口感。EPS具有较高的水结合能力，对整个体系的粘度影响较大。以分离形式用于食品和制药工业的EPS的例子有右旋糖酐或黄原胶。此外，重要的是要知道，由LAB产生的EPS要么附着在细胞壁上(荚膜EPS)，要么释放到周围的培养基中(游离EPS)。发酵剂的工业生产包括两个主要过程步骤，在特定条件下发酵以及随后从发酵液中分离细菌，这通常是用盘堆离心机完成的。在这里，EPS对发酵液粘度的影响使分离步骤变得困难。另一个复杂的因素是不同的发酵剂通常在同一条生产线上生产，这就是为什么分离条件应该根据各自的菌株进行调整。EPS的特性和类型(游离型、荚膜型或两者都有)对发酵液的粘度有特定的影响，因此对细菌的沉积特性也有特定的影响。经验观察表明，在细胞分离前应用高速剪切均质可改善培养物的沉淀特性，但这种改善也取决于所产生的EPS类型。本研究的目的是系统地研究高速剪切均质步骤对产EPS的乳酸菌菌株分离性能的影响。1. 材料和方法1.1 材料研究了六种不同的嗜热链球菌（ST）菌株，这些菌株在平均细胞链长度和产生荚膜EPS的能力上存在差异(表1)。表1 未剪切嗜热链球菌荚膜EPS产量和平均细胞链长度菌株生成荚膜EPS每个细胞链上的球菌数量ST-C+1-5ST-D-2-19ST-E-1-4ST-G+1-8ST-H+1-6ST-I+1-51.2 剪切处理使用T25高速均质机含有ST发酵培养基进行特定剪切。将30ml样品填充到一个试管中，并在5000、11000、19000或24000 rpm的转速下剪切。在每个搅拌速度下，剪切10 s、20 s、30 s、60 s、120 s后取样。1.3 颗粒沉降速度分析用光学分析离心机(LUMiSizer, LUM GmbH, Berlin, Germany)测量未剪切和剪切样品的沉降速度分布。将稀释样品(与生理氯化钠溶液的比例为1:2)填充到每个样品管中，使用3600 rpm进行测试。采用恒定位置法，在靠近样品管底部的三个径向位置(123、125和127毫米) 用SEPView程序计算沉降速度分布。1.4 沉积物压缩行为分析使用LUMiSizer测量样品的沉积物压缩。样品管中加入未稀释的样品，LUMiSizer的速度以500 rpm为步阶在1500 rpm和4000 rpm之间变化。2. 结果与分析2.1 颗粒沉降速度图1 在19000rpm下剪切10 s（长虚线）、30 s（短虚线）和120 s（虚线）后，未剪切（实线）细菌菌株ST-D（游离EPS，灰色）和ST-C（荚膜EPS，黑色）的沉降速度分布由图1可知，未剪切的ST-D沉积速度分布非常广泛，从100 μm/s到近2000 μm/s。这可以归因于细菌形成长细胞链的能力(每链含2-19个球菌，见表1)，导致颗粒物体的体积和表观颗粒尺寸增加。由于分布较广，速度的频率分布 (即在相同速度下沉积的颗粒数量的指标)很低。以19,000 rpm的UT速度剪切10秒，快速沉降颗粒的数量减少了，较慢沉降颗粒的数量增加了。结果，最大速度的频率从0.6(未剪切)增加到1.0(剪切)。这反映了剪切作用对细胞链的部分破坏(图2)。随着剪切时间的增加，细胞链被破坏的程度更大，导致沉积速度进一步降低。在19,000 rpm剪切120 s后，平均链长由13个单元减少到6个单元，在沉降速度为300 μm/s时，最大速度分布密度为2.4。与ST-D相比，剪切后的ST-C沉积速度更高。在120 μm/s左右的沉降速度条件下，未剪切试样的沉降速度主峰值为80 ~ 250 μm/s，最大沉降速度频率为1.4。快速沉降颗粒(可能是细胞链)和缓慢沉降颗粒(可能是细胞碎片或细颗粒)也可见。使用UT在19,000 rpm下剪切10s后，沉降速度分布明显提高。这种变化可以通过检查ST-C产生的荚膜EPS层来解释(见图2未剪切和剪切培养的显微镜图像)。将样品与印度墨水混合，由于墨水颗粒无法渗透到荚膜多糖中，可见在细菌细胞周围呈明亮层。显微镜图像表明，胶囊是在剪切过程中被去除的。由于EPS具有较高的水结合能力，我们假设细胞周围的荚膜EPS层起到了一种摩擦垫的作用，降低了细胞的沉积速度。所以，剪切去掉荚膜EPS层后，沉降速度升高是符合预期的结果。随着剪切时间的增加，沉降速度没有进一步提高，但细胞链断裂明显。剪切120 s后，在沉降速度约为140 μm/s时，最大沉降速度分布密度增大到2.3。这表明在细胞链被破坏之前，荚膜EPS已经被剪切掉。对于产生游离EPS的菌株（ST-E），观察到了类似的结果，即剪切后沉降速度增加，可能是由于发酵液粘度发生了改变。在19,000 rpm的转速下剪切120 s后，无细胞肉汤的表观粘度下降了40%。因此，平均沉降速度由182 μm/s增加到206 μm/s，可以用Stokes定律解释。图2  ST-D（游离EPS菌株）的显微照片未剪切（左上），在24000rpm下剪切120秒（右上）。ST-C（荚膜EPS菌株）的显微照片（印度墨水进行染色）未经剪切（左下），并在24000rpm下剪切120秒（右下）。2.2 能量输入对颗粒沉降速度的影响图3 剪切能输入对细菌细胞沉降速度的影响。应变标识:ST-C，黑色方块;ST-D，黑色圆圈;ST-E，灰色圆圈;ST-G，黑色三角形;ST-H，灰色三角形;ST-I，灰色方块。图3说明了六种ST菌株的沉降速度存在较大差异，剪切处理在不同程度上影响了沉降速度。沉淀最快的菌株是ST-D，它产生游离EPS并形成最长的细胞链（见表1）。另一种产生游离EPS的菌株ST-E的沉降速度明显低于ST-D，而ST-D的沉降速度又高于四种产生荚膜EPS的菌株。这是将荚膜EPS层解释为减速摩擦垫的另一个原因。对于所有菌株，沉降速度与能量输入呈对数依赖性或几乎保持不变。随着能量输入的增加，产生荚膜EPS的菌株表现为沉积速度增加的趋势，该现象可以通过剪切破坏了菌株周围用于减速的荚膜EPS层来解释。3. 结论本研究表明，剪切可以影响发酵培养基中细菌细胞的沉降速度。结果表明:(a)剪切荚膜EPS对沉积速度的影响最大;(b)对于只产生游离EPS的菌株，剪切降低了发酵液表观粘度，从而提高了沉淀速度;(c)长细胞链的破坏导致颗粒尺寸变小，从而导致沉降速度降低。平均沉降速度的比较揭示了这三种影响的组合。由于粘度的变化导致较高的沉降速度，使沉积物形成速度加快，但对沉积物压缩没有影响。细胞链的破坏降低了沉积速度，但由于颗粒尺寸的减小，导致沉积物更加致密。由于剪切作用发酵剂表面的荚膜EPS减少，从而降低了颗粒之间的相互依赖性，因此，导致沉积物的强烈压实，这可能有助于发酵剂生产过程中细胞的分离。 利用 LUMiSizerQ稳定性分析仪系统地研究剪切能的输入与产胞外多糖的嗜热链球菌沉积 特性的关系 (系列一) 近年来，能够产生胞外多糖(EPS)的发酵剂的重要性显著增加，例如几种乳酸菌(LAB)。在发 酵乳制品中， EPS 影响产品粘度和口感。EPS 具有较高的水结合能力，对整个体系的粘度影 响较大。以分离形式用于食品和制药工业的 EPS 的例子有右旋糖酐或黄原胶。此外，重要的 是要知道，由 LAB产生的 EPS 要么附着在细胞壁上(荚膜 EPS)， 要么释放到周围的培养基中 (游离EPS)。 发酵剂的工业生产包括两个主要过程步骤，在特定条件下发酵以及随后从发酵液中分离细 菌，这通常是用盘堆离心机完成的。在这里， EPS 对发酵液粘度的影响使分离步骤变得困难。另 一 个复杂的因素是不同的发酵剂通常在同一条生产线上生产，这就是为什么分离条件应该 根据各自的菌株进行调整。EPS的特性和类型(游离型、荚膜型或两者都有)对发酵液的粘度 有特定的影响，因此对细菌的沉积特性也有特定的影响。经验观察表明，在细胞分离前应用 高速剪切均质可改善培养物的沉淀特性，但这种改善也取决于所产生的 EPS类型。 本研究的目的是系统地研究高速剪切均质步骤对产 EPS 的乳酸菌菌株分离性能的影响。 1.材料和方法 1.1材料 研究了六种不同的嗜热链球菌(ST)菌株，这些菌株在平均细胞链长度和产生荚膜 EPS 的能 力上存在差异(表1)。 表1未剪切嗜热链球菌荚膜 EPS 产量和平均细胞链长度 菌株 生成荚膜 EPS 每个细胞链上的球菌数量 ST-C 十 1-5 ST-D 2-19 ST-E 1-4 ST-G 十 1-8 ST-H 十 1-6 ST-T 十 1-5 1.2剪切处理 使用 T25高速均质机含有 ST 发酵培养基进行特定剪切。将 30ml样品填充到一个试管中，并 在5000、11000、19000或24000 rpm 的转速下剪切。在每个搅拌速度下，剪切 10 s、20 s、30 s、60 s、120 s 后取样。 1.3颗粒沉降速度分析 用光学分析离心机(LUMiSizer，LUM GmbH， Berlin，Germany)测量未剪切和剪切样品的沉 降速度分布。将稀释样品(与 生理氯化钠溶液的比例为1：2)填充到每个样品管中，使用3600rpm 进行测试。采用恒定位置法，在靠近样品管底部的三个径向位置(123、125和127毫 米)用 SEPView 程序计算沉降速度分布。 1.4沉积物压缩行为分析 使用 LUMiSizer 测量样品的沉积物压缩。样品管中加入未稀释的样品，LUMiSizer 的速度以 500 rpm 为步阶在 1500 rpm 和4000 rpm之间变化。 2.结果与分析 2.1颗粒沉降速度 sedimentation velocity [um/s] 图1在19000rpm下剪切 10 s (长虚线)、30s(短虚线)和120s(虚线)后，未剪切(实线)细菌菌 株 ST -D (游离EPS， 灰色)和ST -C (荚膜EPS， 黑色)的沉降速度分布 由图1可知，未剪切的 ST-D 沉积速度分布非常广泛，从100i m/s 到近 2000um/s 。这可 以归因于细菌形成长细胞链的能力(每链含2-19个球菌，见表1)，导 致颗粒物体的体积和 表观颗粒尺寸增加。由于分布较广，速度的频率分布 ((即在相同速度下沉积的颗粒数量的指 标)很低。以 19，000 rpm的 UT速度剪切10秒，快速沉降颗粒的数量减少了，较慢沉降颗粒 的数量增加了。结果，最大速度的频率从0.6(未剪切)增加到1.0(剪切)。这反映了剪切作 用对细胞链的部分破坏(图2)。随着剪切时间的增加，细胞链被破坏的程度更大，导致沉积 速度进一步降低。在 19，000 rpm剪切120s后，平均链长由13个单元减沙到6个单元， 在 沉降速度为300 um/s时，最大速度分布密度为2.4。 与 ST -D 相比，剪切后的 ST -C 沉积速度更高。在120 um/s左右的沉降速度条件下，未剪切 试样的沉降速度主峰值为800~250um/s， 最大沉降速度频率为1.4。快速沉降颗粒(可能 是细胞链)和缓慢沉降颗粒(可能是细胞碎片或细颗粒)也可见。使用 UT 在 19，000 rpm下剪 切 10s后，沉降速度分布明显提高。这种变化可以通过检查 ST-C 产生的荚膜 EPS 层来解释 (见图2未剪切和剪切培养的显微镜图像)。将样品与印度墨水混合，由于墨水颗粒无法渗透 到荚膜多糖中，可见在细菌细胞周围呈明亮层。显微镜图像表明，胶囊是在剪切过程中被去 除的。由于 EPS 具有较高的水结合能力，我们假设细胞周围的荚膜 EPS 层起到了 一 种摩擦垫 的作用，降低了细胞的沉积速度。所以，剪切去掉荚膜 EPS 层后，沉降速度升高是符合预期 的结果。随着剪切时间的增加，沉降速度没有进 一 步提高，但细胞链断裂明显。剪切120 s 后，在沉降速度约为140)um/s时，最大沉降速度分布密度增大到2.3。这表明在细胞链被 破坏之前，荚膜 EPS 已经被剪切掉。对于产生游离 EPS 的菌株(ST -E)，观察到了类似的结 果，即剪切后沉降速度增加，可能是由于发酵液粘度发生了改变。在19，000 rpm 的转速下 剪切120s后，无细胞肉汤的表观粘度下降了 40%。因此，平均沉降速度由182 u m/s增加 到206um/s， 可以用 Stokes 定律解释。 图2ST -D (游离 EPS菌株)的显微照片未剪切 (左上)，在24000rpm 下剪切 120秒(右上)。ST -C (荚 膜 EPS 菌株)的显微照片(印度 墨 水进行染色)未经剪切(左下)，并在24000rpm下剪切120秒(右 下)。 2.2能量输入对颗粒沉降速度的影响 energy i nput [J/ml] 图3剪 切能输入对细菌细胞沉降速度的影响。应变标识：ST-C，黑色方块；ST-D， 黑色圆圈；ST-E，灰色圆 圈；ST -G，黑色 三 角 形 ；ST -H，灰色 三 角 形 ；ST -I，灰色方块。 图3说明了六种ST菌株的沉降速度存在较大差异，剪切处理在不同程度上影响了沉降速度。沉淀最快的菌株是 ST-D， 它产生游离 EPS 并形成最长的细胞链(见表1)。另 一 种产生游离 EPS 的菌株 ST -E 的沉降速度明显低于 ST -D， 而 ST -D的沉降速度又高于四种产生荚膜 EPS 的 菌株。这是将荚膜 EPS 层解释为减速摩擦垫的另一个原因。对于所有菌株，沉降速度与能量 输入呈对数依赖性或几乎保持不变。随着能量输入的增加，产生荚膜 EPS 的菌株表现为沉积 速度增加的趋势，该现象可以通过剪切破坏了菌株周围用于减速的荚膜 EPS 层来解释。 3.结论 本研究表明，剪切可以影响发酵培养基中细菌细胞的沉降速度 。结果表明：(a)剪切荚膜 EPS 对沉积速度的影响最大；(b)对于只产生游离 EPS 的菌株，剪切降低了发酵液表观粘度，从而 提高了沉淀速度；(c)长细胞链的破坏导致颗粒尺寸变小，从而导致沉降速度降低。平均沉降 速度的比较揭示了这三种影响的组合。由于粘度的变化导致较高的沉降速度，使沉积物形成 速度加快，但对沉积物压缩没有影响。细胞链的破坏降低了沉积速度，但由于颗粒尺寸的减 小，导致沉积物更加致密。由于剪切作用发酵剂表面的荚膜 EPS减少，从而降低了颗粒之间 的相互依赖性，因此，导致沉积物的强烈压实，这可能有助于发酵剂生产过程中细胞的分离。